替普瑞酮及雷貝拉唑對急性胃黏膜損傷大鼠TFF3表達的研究

張宏偉，石　莎，盧克美

(聊城市人民醫院1.藥劑科;2.消化內科,山東 聊城　252000)

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替普瑞酮及雷貝拉唑對急性胃黏膜損傷大鼠TFF3表達的研究

張宏偉1，石莎2，盧克美2

(聊城市人民醫院1.藥劑科;2.消化內科,山東 聊城252000)

摘要:目的 研究替普瑞酮及雷貝拉唑對無水乙醇誘發大鼠急性胃黏膜病變的保護性作用及三葉草因子3(TFF3)的表達。方法將大鼠按體重隨機分為5 組，分為正常對照組、模型組、替普瑞酮治療組、雷貝拉唑治療組、替普瑞酮聯合雷貝拉唑治療組(聯合治療組)，每組8 只。用無水乙醇制備大鼠急性胃黏膜病變模型，蘇木精—伊紅染色觀察各組大鼠胃黏膜組織病理學改變，免疫組織化學法測定各組大鼠胃黏膜TFF3的表達情況。結果與模型組比較，各藥物治療組胃黏膜潰瘍指數明顯減少，有顯著性差異(P<0.01)；與替普瑞酮治療組比較，聯合治療組胃黏膜潰瘍指數明顯減少，有統計學意義(P<0.05)；與雷貝拉唑治療組比較，聯合治療組胃黏膜潰瘍指數明顯減少，有顯著性差異(P<0.01)。HE染色結果，與正常對照組比較，模型組大鼠的胃黏膜表面上皮細胞缺失，伴隨大量炎癥細胞浸潤，肌層和漿膜被破壞；與模型組比較，雷貝拉唑、替普瑞酮治療組及聯合治療組的大鼠胃黏膜表層上皮細胞缺失減少，黏膜腺體重現，漿膜結構較完整，且炎癥細胞較少。免疫組織化學結果，與正常對照組比較，模型組及各藥物治療組胃黏膜TFF3的表達顯著增多(P<0.05)。與雷貝拉唑組比較，聯合治療組大鼠胃潰瘍周邊TFF3的陽性細胞密度明顯增加(P<0.05)。結論替普瑞酮與雷貝拉唑可能通過上調 TFF3 的表達改善無水乙醇所致大鼠胃黏膜組織損傷，促進胃黏膜的愈合，對大鼠急性胃黏膜病變起到保護作用。

關鍵詞：替普瑞酮；雷貝拉唑；急性胃黏膜病變；三葉草因子3；保護性作用

急性胃黏膜病變(acute gastric mucosal lesion，AGML)是以胃黏膜發生不同程度糜爛、淺潰瘍和出血為特征的病變。目前臨床主要見于嚴重創傷、危重疾病及心理障礙等應激情況下胃黏膜的急性病變，國內診斷更多的是依靠臨床表現，極其容易被忽視而導致嚴重的后果[1]；應激性胃黏膜病變是顱腦損傷的常見并發癥，發生率為16%～47%，嚴重影響患者的預后，甚至危及患者的生命[2]。三葉因子家族(trefoil factor famuly, TFF)主要由胃腸道黏液細胞分泌的小分子多肽組成，三葉草因子3(TFF3)是TFF成員，TFF3具有抗蛋白酶水解、抗酸消化的特征，對胃腸黏膜的損傷、修復、增殖、惡變都有著重要的關系,如今還證實其可以促進眼角膜的傷口愈合[3]。

眾所周知，雷貝拉唑是一種質子泵抑制劑，替普瑞酮是胃黏膜保護劑的一種，兩者均可以對急性胃黏膜病變起著治療作用，但其作用機制與TFF3之間是否有關系目前國內外未見相關報道。本研究擬觀察替普瑞酮聯合雷貝拉唑對大鼠急性胃黏膜病變組織的保護作用；并探討其保護機制是否與TFF3的表達有關。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物雄性Wistar大鼠，體重190～220 g，40只，由山東大學實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK(魯)20120005。

1.1.2主要儀器及試劑替普瑞酮膠囊(每粒50 mg，衛材藥業有限公司，批號：130482A)，雷貝拉唑腸溶片(每片10 mg，衛材藥業有限公司，批號：120626A)，兔抗人TFF3 多克隆抗體、S-P 試劑盒、枸櫞酸抗原修復緩沖液(武漢博士德生物工程公司)，DAB 染色劑(福州邁新生物技術開發公司)。石蠟切片機(美國820型AO切片機)；低溫離心機(北京四環科學儀器廠有限公司)；恒溫水浴箱(中國江蘇)；全自動γ放免計數儀(上海核子檢測儀器廠)；奧林巴斯DP73顯微鏡成像系統；圖像分析軟件Imagepro-Plus 6。

1.2方法

1.2.1動物模型制備物大鼠適應性飼養1周，室溫在22～25℃，光照時間12 h，實驗前禁食24 h，不禁水，藥物灌胃6 h后進食。按體重隨機分為5 組，每組8 只，分別為正常對照組、模型組、替普瑞酮治療組、雷貝拉唑治療組、替普瑞酮聯合雷貝拉唑治療組(聯合治療組)。正常對照組以生理鹽水(NS)代替藥物灌胃；模型組為無水乙醇1 mL灌胃6 h后觀察；雷貝拉唑治療組：無水乙醇1 mL灌胃6 h后,上午9點20 mg·kg-1灌混懸液1 mL灌胃，持續3 d；替普瑞酮治療組：無水乙醇1 mL灌胃6 h后，下午3點200 mg·kg-1灌混懸液1 mL灌胃，持續3 d；聯合治療組：無水乙醇1 mL灌胃6 h后，上午9點雷貝拉唑20 mg·kg-1，下午3點替普瑞酮200 mg·kg-1分別灌胃，持續3 d。

1.2.2測定胃黏膜損傷指數大鼠上腹部正中切口，將胃完整地切除。切下的胃在室溫下浸于10 mL生理鹽水中，然后沿著胃小彎切開胃并外翻，將胃內容物洗凈。糜蛋白酶及PBS緩沖液沖洗掉表面血跡及黏液，在10倍放大鏡下計數腺胃區點線狀糜爛、出血情況，按Guth[4]標準評估胃黏膜損傷并累計積分：損傷范圍<1 mm(包括糜爛點)計1分；1 mm≤損傷范圍<2 mm計2分；2 mm≤損傷范圍<3 mm計3分；3 mm≤損傷范圍<4 mm計4分；損傷范圍≥4 mm計5分；損傷寬度>2 mm者，分值×2。計算潰瘍指數(ulcer index,UI),全胃各病灶得分之總和即為UI。

1.2.3組織病理學觀察以胃黏膜糜爛部位為中心修剪胃壁組織(正常組在胃前壁近幽門處取組織),留取組織塊約1.00 cm×1.00 cm 大小，10% 中性甲醛固定，按照常規梯度乙醇脫水,二甲苯透明，石蠟包埋, 5 μm厚度連續切片，分別作HE(蘇木素—伊紅)染色和免疫組化使用；切片常規脫蠟、染色、脫水、透明、封固，光鏡下(×400倍)觀察胃黏膜組織的炎癥情況。

1.2.4免疫組化法采用免疫組織化學S-P 法，DAB 染色。切片染色前根據抗體要求行枸櫞酸緩沖液高溫高壓抗原修復。余具體操作過程按試劑盒說明書完成, 并設立陽性對照和陰性對照(以PBS緩沖液代替一抗)，在光鏡下觀察陽性反應呈棕黃色。用奧林巴斯DP73顯微鏡成像系統；圖像分析軟件Image pro-Plus 6在計算機上進行觀察：(1)TFF3的判斷標準：以胞漿內出現棕黃色顆粒視為陽性細胞, 每張切片隨機選擇10 個高倍視野, 計數總細胞數以及陽性細胞數, 并計算陽性細胞率。以≥10%陽性細胞為陽性,<10%為陰性；(2)用成像系統在顯微鏡下隨機圈定面積,在高倍鏡下計數所選區域陽性細胞數, 通過計算陽性細胞的數密度對不同部位胃黏膜進行統計分析；(3)陽性細胞數密度=TFF3陽性細胞數目/所選胃黏膜面積。

1.3統計學分析 采用SPSS14.0統計軟件分析數據觀測資料主要為計量數據，均計算均數±標準差，多組間比較為單因素方差分析，兩兩比較為LSD-t檢驗。均以雙側P<0.05為有統計學意義。

2結果

2.1各組大鼠胃黏膜損傷指數與模型組UI比較，正常對照組、雷貝拉唑組、聯合治療組UI顯著降低(P<0.01)，替普瑞酮組UI降低(P<0.05)。與替普瑞酮組及雷貝拉唑組 UI比較，聯合治療組 UI降低(P<0.01)，見表1。

2.2HE 染色觀察大鼠胃黏膜的組織形態學正常對照組大鼠胃組織結構正常，胃黏膜表面光滑，皺襞整齊清晰，未見糜爛。模型組的大鼠胃黏膜面表層可見壞死組織及其下面的肉芽組織，伴隨大量炎癥細胞浸潤，肌層和漿膜被破壞，腺體間質充血、水腫，有新生小毛細血管形成。與模型組比較，雷貝拉唑、替普瑞酮組及聯合治療組的大鼠胃黏膜表層壞死組織較少，黏膜腺體重現，其下層接近正常，間質充血水腫減輕、漿膜結構較完整，且炎癥細胞及滲出物較少，見圖1。

表1　各組大鼠胃黏膜損傷指數的結果

注：與模型組比較，aP<0.01,bP<0.05；與替普瑞酮及雷貝拉唑組比較，cP<0.01。

2.3免疫組化染色觀察大鼠胃黏膜 TFF3的表達 正常對照組大鼠 TFF3 表達陰性。與模型組比較，替普瑞酮組、雷貝拉唑組及聯合治療組大鼠胃潰瘍周邊TFF3的陽性細胞密度增加，差異具有統計學意義(P<0.05)。與雷貝拉唑組、替普瑞酮組比較，聯合治療組大鼠胃潰瘍周邊TFF3的陽性細胞密度增加，差異有統計學意義(P>0.05)，見表2及圖2。

表2　各組大鼠胃黏膜TFF3陽性細胞數密度的變化(cells/1000 μm2)

注：與模型組比較，aP<0.05；與替普瑞酮及雷貝拉唑組比較，bP<0.05。

3討論

急性胃黏膜病變出現迅速，發病率高，有著潛在的致命性威脅，已經逐漸成為社會關注的課題之一。急性胃黏膜病變的發生機制仍然不明確，但是相關研究表明與胃黏膜炎癥反應失控密切相關[5]。三葉草因子家族就是其中的保護性因子，TFF3( trefoil factor family 3)是三葉因子家族中的一員，正常情況下主要分布于腸黏膜，當胃黏膜受損時，胃黏膜出現TFF3的高表達[6],正常胃黏膜僅含有少量的TFF3[7]。

本研究通過用無水乙醇制備大鼠急性胃黏膜病變模型，與正常對照組比較，模型組大鼠的胃黏膜表面上皮細胞缺失，伴隨大量炎癥細胞浸潤，肌層和漿膜被破壞；模型組大鼠95%酒精造模導致的急性胃黏膜損傷的評分結果與易受鄉等[8]相似；而且在胃黏膜損傷處TFF3陽性細胞表達，與正常對照組比較明顯增多。

替普瑞酮為萜烯類藥物，是一種新型的胃黏膜保護劑，臨床上用于治療各種原因引起的胃潰瘍及慢性胃炎等胃黏膜損傷，與抑酸劑聯用治療消化道潰瘍等。雷貝拉唑是一種質子泵抑制劑，可提高胃液pH值，阻止酸對胃黏膜的侵蝕，其在酸性溶液中不穩定，適宜于制備成腸溶制劑[9]。制酸劑和黏膜保護劑都能促進潰瘍愈合，黏膜保護劑能明顯提高潰瘍的愈合質量。雷貝拉唑與替普瑞酮可以通過多種途徑對NSAIDs 所致胃損傷起保護作用[10]，王晗等[11]證實，替普瑞酮和雷貝拉唑可以通過抑制occludin 和ZO-1 的表達減少，從而改善黏膜屏障功能。替普瑞酮具有促進NO合成及誘導HSP等作用[12]，但是其與TFF3之間的關系未見報道。

本研究證實與模型組比較，各藥物治療組胃黏膜潰瘍指數明顯減少；與替普瑞酮或雷貝拉唑治療組比較，聯合治療組胃黏膜潰瘍指數明顯減少。與模型組比較，雷貝拉唑、替普瑞酮治療組及聯合治療組的大鼠胃黏膜表層上皮細胞缺失減少，黏膜腺體重現，漿膜結構較完整，且炎癥細胞較少。免疫組織化學結果，與正常對照組比較，模型組及各藥物治療組胃黏膜TFF3陽性細胞顯著增多。

三葉因子對胃黏膜的保護作用機制眾多[13]，其可以和黏蛋白相互作用增強胃黏膜防御屏障；還通過E-鈣黏連素/β-連接素促進細胞遷移來修復細胞的損傷[14]；還可以通過iNOS和EGF-R等參與血管生成。本試驗證實TFF3在乙醇引起的急性胃黏膜損傷過程中起到胃黏膜的保護作用，應用外源性TFF3 能減輕急性胃黏膜的損傷[15]。而TFF3究竟通過何種途徑發揮其胃黏膜損傷作用的，至今還未見報道，以后我們還將深入研究。

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doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.12.009

基金項目:聊城市科學技術攻關計劃項目(No 2014-2-134)

(收稿日期：2015-07-29，修回日期：2015-08-14)

Expression of TFF3 in rats with acute gastric mucosal
lesion treated by Teprenone and Rabeprazole

ZHANG Hong-wei1, SHI Sha2,LU Ke-mei2

(1.DepartmentofGastroenterology;2.DepartmentofPharmacology,

LiaochengPeople’sHospital,Liaocheng,Shandong252000,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the expression of TFF3 and the protective role of Teprenone and Rabeprazole in rats with acute gastric mucosal lesion. Method Forty wistar male rats were randomly assigned into normal control group, model group, teprenone group, rabeprazole group and teprenone/rabeprazole group, with 8 rats in each group. Acute gastric mucosal lesion model was induced by absolute ethylalcohol. Gastric tissue pathological changes were performed by hematoxylineosin staining，and gastric ulcer index was evaluated．Expression of TFF3 in gastric mucosa was detected by immune histochemical method. Results (1) UI of drug treatment groups was significantly lower than that of model group(P<0.01); UI of combination group was lower than that of teprenone group(P<0.05);UI of combination group was lower than that of rabeprazole group(P<0.01).(2) Hematoxylineosin staining results were as follows:Compared with control group, epithelial cells were deficient on gastric mucosa surface in model group, with a large number of inflammatory cells infiltration as well as muscularis and serosa destroyed; By comparison with model group, in rabeprazole group, teprenone group and rabeprazole/teprenone group deficiency of epithelial cells of gastric mucosa surface was less, mucous glands reappeared, and serous membrane structure was relatively complete with less inflammatory cells and exudate.(3)Immunohistochemical results were as follows:Expression of TFF3 positive cells in model group and drug intervention group was significantly increased, which was significantly higher than that in normal control group(P<0.05). ConclusionRabeprazole and teprenone may protect gastric mucosa tissues by raising TFF3 expression，promote the healing of gastric mucosa and alleviate the acute gastric mucosa injury in rats.

Key words:teprenone;rabeprazole;acute gastric mucosal lesion;trefoil factor 3;protection