柱前衍生化法分析木槿花多糖中單糖組成

王靜，孫盼盼，曹際云

德州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院（德州 253023）

木槿（Hibiscus syriacusL.），是一種錦葵科木槿屬落葉植物，是一種很常見的庭園灌木花，通常生長于道路兩旁、公園、庭院等處[1]。木槿花（FlosHibiscus），屬于錦葵科木槿花，其花開時節(jié)，花朵會接力而開，又叫無窮花，也叫日及、朝開暮落花等。其大多顏色嬌艷，花瓣有純白、淡粉、淡紫、紫紅等顏色，有單瓣、復(fù)瓣、重瓣等形態(tài)，以花朵大而完整、色純無雜質(zhì)為佳。木槿花含有蛋白質(zhì)、脂肪、纖維及還原糖等，營養(yǎng)價值很高，既有食用價值，可做成木槿花餅、木槿花粥、木槿花茶、木槿花鯽魚、木槿花豆腐湯等，具有一定的藥用價值，木槿花入藥具有殺菌消炎、抗氧化、清熱利濕、涼血解毒的功效[2-4]，也可用于治療腸風(fēng)瀉血、肺熱咳嗽燙傷等病癥。

多糖在植物花朵中廣泛存在，是一類至少由10個含有醛基或者羰基的單糖通過糖苷鍵連接而成的聚合糖高分子化合物，具有抑菌、抗氧化、抑制腫瘤，降血糖、降血脂、免疫調(diào)節(jié)等作用[5-7]，對多糖的生物功能進(jìn)行研究具有重要意義。

金友權(quán)等[8]初步測定木槿花的多糖組成，但對相關(guān)試驗方法還未進(jìn)行深入研究。在此基礎(chǔ)上，選取江蘇省的白色重瓣木槿花為試驗對象，通過對木槿花的一系列處理，利用柱前衍生化-HPLC法[9-11]對木槿花多糖的單糖組成進(jìn)行分析并對試驗方法進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計，為木槿花多糖后續(xù)發(fā)展提供基礎(chǔ)。

1 儀器、試劑與材料

UltiMate3000高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技中國有限公司）；Thermo ScientificTMAcclaimTMC18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，賽默飛世爾科技中國有限公司）；恒溫水浴鍋（常州金壇良友儀器公司）；TGL-16R型高速冷凍離心機（山東百歐醫(yī)療科技公司）；HH-S型數(shù)顯恒溫油浴鍋（江蘇科析儀器公司）；FA1004電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）。

對照品：無水葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖醛酸（無水葡萄糖純度≥99%，其他4種單糖純度≥98%，合肥博美生物科技公司）。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP，含量≥99%，天津科密歐化學(xué)試劑公司）；甲醇、乙腈（均為色譜純，含量≥99.9%，天津大茂化學(xué)試劑廠）；乙酸銨（色譜純，含量≥98%，天津市科密歐化學(xué)試劑公司）；鹽酸、三氯甲烷、氫氧化鈉等（均為分析純）；試驗用水為超純水。

白色重瓣木槿花（市售）。

2 方法與結(jié)果

2.1 液相色譜條件優(yōu)化

2.1.1 混合單糖對照品衍生化供試液處理

取葡萄糖醛酸、木糖、半乳糖、無水葡萄糖、阿拉伯糖各20 mg，溶于20 mL超純水中，制成1 mg/mL的單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

分別取200 μL各單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，混合，加入1.0 mL 0.5 mol/L的PMP甲醇溶液和0.5 mL 0.5 moL/L的NaOH溶液，并進(jìn)行渦旋振蕩5 min混勻，在70 ℃下水浴加熱60 min，取出靜置，冷卻至室溫，加入鹽酸調(diào)溶液pH為中性或弱酸性，加入三氯甲烷進(jìn)行萃取，共萃取3次，每次加入1 mL，振蕩2～3 min，按5 000 r/min離心5 min，每次均取上清液，第3次上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，上樣前進(jìn)行超聲去除溶液中的氣泡。

2.1.2 柱溫考察

設(shè)定柱溫25，30和35 ℃，將2.1.1中處理好的混合單糖溶液進(jìn)行上樣測定。根據(jù)所得試驗結(jié)果，可得到柱溫對單糖的出峰時間影響很小，因此柱溫設(shè)定為30 ℃。

2.1.3 流動相考察

分別采用0.02，0.06和0.10 mol/L的乙酸銨溶液作為流動相，將2.1.1處理的混合單糖溶液進(jìn)行上樣測定。由試驗測定結(jié)果可知，乙酸銨濃度越高，峰形對稱性越好，因此選用0.1 mol/L的乙酸銨溶液作為流動相。

2.1.4 流動相比例考察

設(shè)定流動相為乙酸銨-乙腈為84+16，82+18和80+20（V/V）這3種不同比例，用2.1.1中處理所得溶液進(jìn)行上樣。試驗結(jié)果表明，乙酸銨溶液占比越低，樣品分離越好，因此選用的流動相為乙酸銨-乙腈體積比80+20（V/V）。

2.2 多糖水解條件優(yōu)化

2.2.1 木槿花多糖溶液制備

稱取0.105 7 g木槿花粗多糖粉末，加入10 mL超純水溶解，得到10.57 mg/mL的多糖溶液，可放置在4 ℃溫度下保存，用于后續(xù)試驗操作。

2.2.2 多糖水解用酸濃度考察

取3份2.2.1小節(jié)的多糖溶液，每份1 mL。分別向3份多糖溶液中加入1 mol/L鹽酸溶液、3 mol/L鹽酸溶液、5 mol/L鹽酸溶液各1 mL，并進(jìn)行渦旋振蕩5 min，混勻，在110 ℃溫度下水解60 min，取出靜置冷卻至室溫，加入NaOH溶液調(diào)pH為中性，得到木槿花多糖水解液。取上述3份多糖水解液各200 μL，按照2.1.1小節(jié)的方法處理，測定結(jié)果見表1。根據(jù)測定結(jié)果可知，不同濃度鹽酸水解后木槿花多糖含有的單糖的峰面積增減趨勢并不一致。綜合考慮，水解用鹽酸濃度為1 mol/L。

表1 單糖衍生物在不同濃度鹽酸水解后的峰面積

2.2.3 多糖水解溫度考察

取3份2.1.1小節(jié)的多糖溶液，每份1 mL。分別向3份多糖溶液中加入1 mL的1 mol/L鹽酸溶液，并進(jìn)行渦旋振蕩5 min，混勻，分別在90，110和130 ℃下水解1 h，冷卻至室溫，加入NaOH中和，得到木槿花多糖水解液。取上述3份多糖水解液各200 μL，按照2.1.1小節(jié)的方法處理，測定結(jié)果見表2。綜合試驗測定結(jié)果，水解溫度確定為110 ℃。

表2 單糖衍生物在不同溫度水解后的峰面積

2.2.4 多糖水解時間考察

取3份2.1.1小節(jié)的多糖溶液，每份1 mL。分別加入1 mL 1 mol/L鹽酸溶液，并進(jìn)行渦旋振蕩5 min，混勻，在110 ℃下分別水解30，60和90 min，冷卻至室溫，加入NaOH中和，得到木槿花多糖水解液。取3份多糖水解液各200 μL，按照2.1.1小節(jié)的方法處理，測定結(jié)果見表3。綜合考慮，確定水解時間為60 min。

表3 單糖衍生物在不同時間下水解的峰面積

2.3 衍生化條件考察

2.3.1 衍生化溫度考察

取3份木槿花多糖水解液，每份200 μL，均加入300 μL 0.5 mol/L PMP甲醇溶液和200 μL 0.5 mol/L NaOH溶液，并進(jìn)行渦旋振蕩5 min，混勻，分別在50，70和90 ℃水浴1 h，后續(xù)按照2.1.1小節(jié)的方法處理，測定結(jié)果見表4。綜合試驗測定結(jié)果，選用70 ℃的衍生化溫度。

表4 不同衍生化溫度處理各單糖衍生物峰面積

2.3.2 衍生化時間考察

取3份木槿花多糖水解液，每份200 μL，均加入300 μL 0.5 mol/L PMP甲醇溶液和200 μL 0.5 mol/L NaOH溶液，并進(jìn)行渦旋振蕩5 min，混勻，分別在70℃水浴30，60和90 min，后續(xù)按照2.1.1小節(jié)的方法處理，測定結(jié)果見表5。綜合試驗測定結(jié)果，衍生化時間選用90 min。

表5 不同衍生化時間下各單糖衍生物峰面積

2.4 木槿花中多糖水解產(chǎn)物單糖的含量測定

2.4.1 高效液相色譜條件

C18型色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為1 mol/L乙酸銨溶液-乙腈（80+20，V/V）；柱溫30 ℃；檢測波長250 nm；流速1 mL/min；進(jìn)樣體積10 μL。

2.4.2 供試品溶液制備、水解及衍生

制備：取白色重瓣木槿干花將其研磨成粉末，過篩，通過索氏提取器用石油醚進(jìn)行脫脂處理，脫脂后烘干備用。取脫脂粉溶于蒸餾水中（m脫脂粉∶m蒸餾水=1∶30），在80 ℃下水浴2 h，取出冷卻至室溫，在4 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min，將離心后得到的上清液進(jìn)行醇沉24 h（上清液-無水乙醇體積比1∶4），再進(jìn)行離心，將沉淀溶于水，并進(jìn)行旋蒸操作去除殘留的無水乙醇；第1次離心后的沉淀再次進(jìn)行水提、離心、醇沉、旋蒸等操作。將2次旋蒸后的溶液進(jìn)行合并，用Sevage法（氯仿與正丁醇體積比4∶1）將多糖溶液中的蛋白質(zhì)去除，得到木槿花粗多糖溶液。將粗多糖溶液進(jìn)行冷凍干燥得到木槿花粗多糖粉末。取0.021 0 g粗多糖粉末溶于2 mL超純水中，制成10.50 mg/mL的多糖溶液。

水解、衍生：取1 mL木槿花多糖溶液，加入1 mL 1 mol/L鹽酸溶液，混勻，渦旋振蕩5 min，于110 ℃水解60 min，冷卻至室溫，用NaOH溶液調(diào)pH為中性。取200 μL多糖水解液，加入300 μL的0.5 mol/L PMP甲醇溶液和200 μL的0.5 mol/L NaOH溶液，渦旋振蕩5 min，混勻，在70 ℃溫度下水浴加熱90 min，冷卻至室溫，用鹽酸調(diào)pH至中性或弱酸性。加入三氯甲烷萃取，共萃取3次，每次加入1 mL，并振蕩2～3 min使萃取更充分，在5 000 r/min下離心5 min，每次均取上清液，第3次上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，上樣前進(jìn)行超聲去除溶液中的氣泡。

2.4.3 系統(tǒng)適用性試驗

將PMP空白對照溶液、混合單糖溶液、木槿花多糖溶液分別進(jìn)行上樣，得到3個色譜圖，見圖1。從圖1可觀察到，木槿花多糖溶液與混合單糖溶液中葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸及PMP空白對照溶液的保留時間大體一致，且多糖溶液中各單糖的分離程度比較好。

圖1 3種溶液高效液相色譜圖

2.4.4 線性關(guān)系

取5種單糖的不同濃度梯度溶液各1 mL，按照2.4.2小節(jié)中相關(guān)操作進(jìn)行衍生化處理，后進(jìn)行上樣。質(zhì)量濃度x（mg/mL）和峰面積y分別為橫縱坐標(biāo)，計算得到5種單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，見表6。

表6 5種單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.5 精密度

取多糖溶液，按照2.4.2小節(jié)中相關(guān)操作進(jìn)行處理，后連續(xù)上樣測定6次，記錄峰面積，計算得到SRSD分別為0.829%，0.735%，1.331%，1.610%，0.553%和0.592%，均小于2%，表明儀器具有良好的精密性。

2.4.6 重復(fù)性

取木槿花多糖溶液份，按照2.4.2小節(jié)中相關(guān)操作進(jìn)行處理，后進(jìn)行上樣測得峰面積，計算得到其SRSD分別為0.579%，0.962%，1.138%，1.446%，1.491%和1.557%，均小于2%，表明試驗得到的分析方法重復(fù)性較好。

2.4.7 穩(wěn)定性

取木槿花多糖溶液，按照2.4.2小節(jié)中相關(guān)操作進(jìn)行處理，分別在處理后0，2，4，8，12，18和24 h進(jìn)行上樣測定，記錄峰面積，計算得到其SRSD分別為0.847%，0.925%，0.977%，1.146%，1.471%，1.339%和1.611%，表明由試驗得到的分析方法處理后的多糖溶液穩(wěn)定性較好。

3 結(jié)論

試驗利用柱前衍生化-HPLC法對木槿花多糖中單糖組成進(jìn)行分析，對液相色譜條件、多糖水解條件和衍生化條件進(jìn)行考察優(yōu)化，主要通過對柱溫、流動相濃度、流動相比例的考察確定液相色譜條件，即30 ℃柱溫，流動相條件為乙腈-0.1 mol/L乙酸銨溶液（20+80，V/V）。對水解用鹽酸濃度、水解時間、水解溫度進(jìn)行考察，確定水解條件，即1 mol/L鹽酸溶液、110 ℃水解溫度、60 min水解時間。對衍生化條件進(jìn)行考察，確定衍生化條件，即70 ℃衍生溫度、90 min衍生時間。試驗以白色重瓣木槿花為原材料，經(jīng)過粉碎、脫脂、醇沉、除蛋白等操作得到木槿花粗多糖，經(jīng)過水解、衍生化處理進(jìn)行上樣測定，得到多糖的單糖組成，木槿花多糖中含有葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖和葡萄糖醛酸，各單糖的含量不同有一定差異。試驗表明該方法精密度和準(zhǔn)確度較高，結(jié)果穩(wěn)定可靠，可以用來分析木槿花多糖中的單糖組成，可為木槿花后續(xù)研究提供一定基礎(chǔ)，對木槿花多糖的質(zhì)量控制提供一定價值和意義。