堿性成纖維生長因子在脂肪干細胞治療心肌梗死中的作用

覃杰 閆翠 陳極鋒 單鴻

干細胞治療有望治愈心肌梗死和預防慢性心力衰竭，但倫理、干細胞來源有限及異體干細胞免疫排斥等問題尚未解決，阻礙了干細胞在臨床的進一步應用[1-3]。Yeh 等[3]報道脂肪干細胞(ADSC)可向多種細胞分化，并能分泌多種細胞因子。李博等[4]報道ADSC能有效改善心肌梗死后的心功能。與骨髓間充質干細胞、胚胎干細胞和臍帶血干細胞等相比，ADSC具有來源廣泛、容易取材、損傷較小、自體移植無免疫排斥、體外增殖速度快優勢[3-4]。使用ADSC移植可克服倫理、干細胞來源有限及異體干細胞免疫排斥等問題，但單純使用ADSC移植治療心肌梗死，效果欠佳[2-4]。Zhang等[5]報道堿性成纖維生長因子(bFGF)可促進內皮細胞和平滑肌細胞增殖，增加新生血管，提高局部血流量。Yao等[6]報道bFGF可提高梗死區域血管密度，減少心肌梗死面積。少有文獻研究報道bFGF在ADSC治療心肌梗死的作用。為此，本研究使用ADSC及bFGF移植治療心肌梗死，探討bFGF在ADSC治療心肌梗死中的作用。

材料與方法

一、ADSC的分離培養及標記

取大鼠腹股溝脂肪組織，以磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗碎片及血細胞。在37℃下用0.1 g/L I型膠原酶(Sigma)消化脂肪組織后離心、過濾、重懸，接種至培養皿培養，3 d后換液，棄除未貼壁細胞，每隔3 d換液，貼壁細胞長至90%時，使用胰酶消化傳代，并用PKH26標記細胞。

二、流式細胞分析

使用 PE標記的抗大鼠 CD29(Biolegend)、FITC標記的 CD90(Biolegend)、FITC標記的CD45(Biolegend)以及PE標記的CD34(Santa Cruz)抗體進行流式細胞分析。4℃恒溫避光孵育30 min后，PBS沖洗2次，離心棄上清液。用10 g/L多聚甲醛(PFA)溶液固定，設同型對照，4 h內完成流式細胞儀(FACS)檢測。

三、ADSC的分化潛能鑒定

成脂誘導:1.0×105細胞/孔的密度接種于6孔培養板，待細胞密度大于90%后，加入含100 ml/L胎牛血清、10-8mol/L地塞米松、5 μg/ml胰島素的H-DMEM成脂誘導液，于37℃、體積分數為5%CO2恒溫培養箱中繼續培養，每3 d更換新鮮誘導液。誘導分化20 d后棄成脂誘導液，PBS洗3次，1 g/L中性甲醛室溫固定1 h，PBS清洗后加入油紅O染色1 h，蒸餾水沖洗，顯微鏡(×400)下觀察細胞內脂滴的形成情況。

成骨誘導:以1.0×105細胞/孔的密度接種于6孔培養板中。當細胞長至80%融合時，將培養基更換為含100 ml/L胎牛血清、10-8mol/L地塞米松、50 μg/ml維生素 C、10 mmol/L β-磷酸甘油鈉的成骨誘導液，于37℃、體積分數為5%CO2恒溫培養箱中繼續培養，每隔3 d更換新鮮誘導液。誘導分化第14日吸去成骨誘導液，室溫下用1 g/L中性甲醛固定30 min，PBS清洗后加入茜素紅(pH=4)滴染3～5 min，顯微鏡(×400)下觀察鈣結節的形成情況。

四、心肌梗死模型與細胞移植

65只SD大鼠由中山大學實驗動物中心提供。本研究經中山大學附屬第三醫院倫理委員會批準。用戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，使用容量可調的動物呼吸機輔助呼吸。打開胸廓后，剪開心包，用6-0聚丙烯縫線在距起源2～3 mm的位置結扎左冠狀動脈前降支(LAD)。結扎成功時LAD供血部位(左心室前壁)立即變白，搏動減弱，心電圖示ST-T段弓背抬高。心肌梗死造模1周后，死亡5只，將剩余60只大鼠隨機分成4組(PBS組、bFGF組、ADSC組和ADSC+bFGF組)，每組15只。PBS組單純注射PBS，bFGF組單純注射bFGF，ADSC組注射含4×106ADSC懸液，ADSC+bFGF組注射含4×106ADSC的bFGF懸液。

五、LVEF檢測及心臟組織學檢測

心肌梗死后4周用14.0 MHz探頭行大鼠心臟超聲檢查，測量LVEF。

心臟超聲檢查后處死動物，迅速取出心臟凍存于新鮮的OCT冰凍培養基中或者固定于4%多聚甲醛，用于制備冰凍或者石蠟切片。梗死面積計算:梗死區的心內圓周長/整體心內圓周長×100%。每一個標本梗死面積為5個代表性切面的梗死面積平均值。

六、免疫熒光與免疫組織化學染色

組織切片以抗cTnT(Santa Cruz)、抗平滑肌肌動蛋白SMA(美國Sigma)、抗vWAg(丹麥Dako)進行免疫染色。免疫組織化學染色采用DAB顯色法。在Ⅷ因子染色的切片上測量梗死區微血管數量:先在100倍鏡下識別梗死區，后在200倍下計算血管的數量。計算所有管腔中被橫切的血管數。每一標本取5個代表性的切片，每一切片在光學顯微鏡下計數5個代表性視野，取平均值。

七、統計學處理

結 果

一、4組心肌梗死大鼠的基本情況

4組大鼠的性別比例比較差異無統計學意義(P=0.23)，體質量比較差異亦無統計學意義(P=0.17)，見表1。

表1 4組心肌梗死大鼠的基本情況

二、ADSC特征及誘導

成功分離ADSC，流式細胞分析結果顯示絕大多數ADSC表達CD29和CD90，不表達 CD34和CD45。多向誘導分化結果顯示ADSC可分化為脂肪和骨骼。成脂誘導分化20 d后，油紅O染色結果見成簇脂肪滴形成(圖1A)。成骨誘導分化14 d后，茜素紅染色結果可見大量骨組織(圖1B)。

圖1 ADSC成脂及成骨誘導分化(×400)

三、4組心肌梗死大鼠的LVEF比較

4組 LVEF比較有差異(F=146.45，P＜0.01)。其中，ADSC+bFGF組及ADSC組的LVEF高于PBS組和bFGF組(P＜0.01)，ADSC+bFGF組的LVEF高于ADSC組(P＜0.01)，PBS組和bFGF組的LVEF比較差異無統計學意義(P=0.33)，見圖2。

四、4組大鼠的心肌梗死面積比較

4組心肌梗死面積比較差異有統計學意義(F=114.56，P＜0.01)。其中，ADSC+bFGF組及ADSC組的心肌梗死面積小于PBS組和bFGF組(P＜0.01)，ADSC+bFGF組的心肌梗死面積小于ADSC組(P＜0.01)，PBS組和bFGF組的心肌梗死面積比較差異無統計學意義(P=0.28)(圖3AE)。

圖2 各組心肌梗死大鼠的LVEF比較

五、ADSC分化

ADSC移植4周后，組織切片免疫熒光染色顯示在注射部位出現PKH26陽性且SMA陽性、cTnT陽性和vWAg陽性細胞。

六、各組大鼠梗死部位新生血管比較

免疫組織化學染色結果顯示新生毛細血管數量由多到少依次為 ADSC+bFGF組 [(235.26±24.12)個/mm2]、ADSC組 [(176.28±20.22)個/mm2]、bFGF組 [(118.60±21.46)個/mm2]及PBS組 [(64.58±18.88)個/mm2]，見圖4AD。各組大鼠新生血管密度比較差異有統計學意義(F=519.20，P＜0.01)，見圖4E。

討 論

為了更有效地治療心肌梗死，國內外研究人員在初期的動物實驗中利用骨髓間充質干細胞、胚胎干細胞及臍帶血干細胞等治療心肌梗死取得了較好的成績，并進入臨床試驗階段[2-5]。本研究結果顯示大鼠ADSC可成功誘導為脂肪細胞、成骨細胞，說明ADSC具有多項分化潛能，與文獻報道一致[3-4]。因此，本研究采用ADSC可解決倫理、干細胞來源有限及異體干細胞免疫排斥等問題。

圖3 各組大鼠的心臟大體標本及梗死面積比較

圖4 各組心肌梗死大鼠新生毛細血管數量比較

雖然早期動物實驗顯示干細胞治療可提高左心功能，但近期 Naumova等[7]在動物實驗中發現胚胎干細胞移植后LVEF略有增加的主要原因是旁分泌作用，而不是干細胞分化為心肌細胞，因為只有少于0.5%的胚胎干細胞分化為心肌細胞。我們前期動物實驗結果亦顯示骨髓間充質干細胞未能明顯提高LVEF，干細胞在7 d內大量死亡。REPAIRAMI及BOOST試驗等大型隨機對照實驗顯示在短期及12～18個月隨訪中干細胞移植均未能明顯改善心功能、減少梗死面積和瘢痕組織重塑[8-9]。

干細胞治療心肌梗死療效低于預期的原因較多，常見的有宿主炎癥反應、機械損傷、適應不良、缺血或缺血再灌注損傷、細胞凋亡等[8-10]。Yao等[6]報道bFGF可提高梗死區域血管密度，減少心肌梗死面積。在4組大鼠的基本條件一致的基礎上，本研究發現ADSC+bFGF組及ADSC組的LVEF高于PBS組和bFGF組，ADSC+bFGF組的LVEF高于ADSC組，PBS組和bFGF組的LVEF比較差異無統計學意義。此結果說明bFGF能促進ADSC改善心功能，而單純bFGF并未能改善心臟功能。此外，ADSC+bFGF組心肌梗死面積最小，提示bFGF能促進ADSC縮小梗死面積，改善心功能。

為了探討bFGF在ADSC治療心肌梗死中的作用及機制，我們在ADSC移植4周后取大鼠心臟做免疫組織熒光染色及Ⅷ因子免疫組織化學染色。免疫組織熒光染色顯示在注射部位出現PKH26陽性且SMA陽性、cTnT陽性和vWAg陽性細胞，說明ADSC可分化成心肌細胞、小血管以及血管內皮細胞。Ⅷ因子免疫組織化學染色結果顯示，毛細血管數量由多高到少依次為ADSC+bFGF組、ADSC組、bFGF組及PBS組，各組間新生血管密度比較差異有統計學意義，說明bFGF能促進ADSC分化為新生毛細血管，改善心肌梗死部位的供血，提高移植細胞存活，促進心肌梗死愈合，縮小梗死面積，提高心功能。

綜上所述，bFGF能夠促進ADSC分化為心肌細胞和新生毛細血管，改善心功能，有望促進干細胞治療心肌梗死在臨床的應用。

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