運用Volocity軟件分析T細胞與樹突狀細胞的動態相互作用*

程雪蓮 李文文 孫志娜 梁昊岳 楊晚竹 馮曉明*

細胞圖像處理技術是采用數字圖像處理和計算機模式識別進行的顯微圖像定性和定量分析，在臨床診斷和治療中發揮著越來越重要的作用，是生物醫學工程領域的研究熱點[1-2]。隨著成像技術的發展，顯微細胞圖像已經從二維靜態圖像逐漸發展到二維序列圖像及三維圖像，但是這些圖像在提供了更多信息的同時，也給傳統細胞圖像分析技術帶來了挑戰[3]。Volocity軟件(PerkinElmer公司)是一款適用于三維和四維圖像的高靈敏圖像處理軟件，不僅可獲得非常好的信號檢測，并具有強大的數據分析功能[4-5]。

樹突狀細胞(dendritic cell，DC)是已知機體內功能最強的抗原遞呈細胞，其與T細胞的相互作用決定免疫應答的啟動與否[6]?？乖R別過程中，兩者會在細胞接觸界面之間形成免疫突觸，進而增強T細胞識別抗原的能力以及參與T細胞細胞因子分泌等[7-9]。細胞間作用對免疫系統具有重要的影響，準確的表征細胞間動態作用更加的迫切[10-11]。而隨著科學儀器的發展、熒光染料的改進以及分析方法的開發(如量子點標記等)，將極大促進免疫研究領域的發展[12-13]。為此，本研究將流式細胞儀分選得到的DC和T細胞共同培養，使用PerkinElmer激光共聚焦顯微鏡進行拍攝，通過Volocity軟件對兩種細胞間動態作用進行分析，全面建立研究T細胞與DC的相互作用的方法。

1 材料與方法

1.1 設備與材料

(1)雙轉盤激光共聚焦顯微鏡(UltraVIEW，PerkinElmer，美國)、流式細胞儀(arriaⅢ，BD，美國)。

(2)C57BL/6J小鼠(SPF級)購自中國醫學科學院血液學研究所實驗動物中心；Biotin-anti-mouse CD3磁珠購自德國美天妮公司；APC-labeled Antimouse CD11c、PE-labeled Anti-mouse MHC均購自美國BD公司；CSFE染料和脂多糖購自美國Sigma公司；CellTrackerTMBlue CMAC Dye購自美國Invitrogen公司。

1.2 實驗方法

采用頸椎脫臼法處死C57BL/6J小鼠，無菌條件下取小鼠脾臟，研磨后300目的無菌濾網過濾成單細胞懸液，分離淋巴細胞；通過免疫磁珠分選獲得CD3+的T細胞。DC由流式細胞儀分選獲得，將脾臟研磨后的單細胞懸液進行流式細胞分選，得到CD11c+MHCⅡ+的DC，對1 μg/ml的脂多糖誘導培養24 h后為成熟的DC。

1.3 激光共聚焦顯微鏡拍攝設置

將T細胞和DC分別標記CFSE(Sigma)和CellTrackerTMBlue CMAC Dye(Invitrogen)熒光染料。PerkinElmer激光共聚焦顯微鏡拍攝，拍攝條件為37 ℃，5%CO2，拍攝時間為30 min。分別選用488 nm激光(激光強度10%，300 ms)、405 nm激光(激光強度8%，820 ms)以及可見光(60 ms)進行拍攝，設置圖像的分辨率為1000×1000。三維圖像拍攝時Z軸間隔距離為1 μm，拍攝間隔時間為30 s。選用物鏡放大倍數分別為20倍和60倍。

1.4 Volocity軟件分析

Volocity軟件分析步驟：①圖像識別和細胞分割后，再進行具體參數分析。圖像的識別是根據熒光閾值和檢測面積進行檢測條件設定；圖像分割主要包括閾值分割、邊緣檢測及分水嶺分割3種方法；②細胞的形態參數包括表面積、周長、形狀因子、骨架長度及骨架直徑等；③軟件分析細胞運動軌跡包括細胞的位置、速度及接觸時間等；④細胞的接觸面積可通過Volocity軟件自帶程序直接完成。

2 實驗結果

2.1 圖像識別

使用Volocity對DC和T細胞識別是識別目標的熒光強度。首先設定熒光強度的閾值，高于閾值即為檢測樣品，低于閾值的即設定為背景。同時設定檢測熒光區域的面積，小于該面積為雜質，大于該面積則為檢測樣品。通過調整Volocity軟件識別熒光強度的閾值和檢測面積的大小，使識別T細胞的數量由45個增加到61個，達到人工計數。然而，目前尚無一個金標準用來確定獲得最佳的閾值和面積，因此細胞不規則、分辨率不同及不同實驗人員分析等都將導致結果的不一致性[4-5](如圖1所示)。

圖1 Volocity對T細胞和DC識別成像圖

2.2 DC形態分析

細胞形態是生物學活性和功能的重要表現形式，DC的形態變化可能與抗原遞呈能力、促進B細胞的活化和調節體液免疫等功能相關[14]。基于Volocity軟件對其研究，形狀因子是細胞形態變化的重要參數(如圖2所示)。

圖2 細胞形狀趨向圖

圖2顯示，隨著時間延長，DC的周長和面積的變化均無明顯規律，但是DC的形狀因子逐漸降低，細胞形狀趨向于不規則。形狀因子比周長和面積更加敏感，骨架長度和直徑也是Volocity的兩個重要參數，骨架長度為細胞中最長的軸，直徑為與長軸垂直的最長的弦。兩個參數可以反應細胞外形中心對稱的程度，其不受平移、旋轉等的影響。圖2中骨架長度略有增長，骨架直徑無明顯的變化，形狀趨向于不規則，與形狀因子結果一致。離心率、曲率、基于徑向半徑差的細胞形變以及表面粗糙程度等參數也在其他軟件中用于描述細胞形態的變化[15-16]。

2.3 Volocity軟件和手動分析T細胞的運動軌跡

Volocity軟件計算細胞軌跡包括圖像的分割(軌跡的空間方面)和圖像間的聯系(時間方面)兩個步驟[17](如圖3所示)。

圖3 手動和Volocity分析T細胞的運動軌跡圖

圖3a顯示，T細胞在30 min內發生了明顯的運動，部分細胞伸展偽足；圖3b中手動和軟件分析T細胞的總體運動軌跡和方向是一致的，但手動分析的運動距離明顯偏大。9號T細胞是軌跡差別最大的細胞，經過分析發現隨著曝光時間的延長，熒光強度逐漸低于檢測閾值，軟件無法對其進行識別，造成了兩種分析方法的差異。8號T細胞的差異可能是與鄰近細胞太近以致無法區分，造成實驗結果的誤差。剩余細胞也存在兩種分析方法的部分差異，盡管手動分析細胞是計算細胞運動軌跡的金標準，但當研究大量細胞長時間的運動軌跡時，節約時間和重復性好等優點使軟件分析成為首選[18]。但是由于采集的圖像不均一、細胞密度高、細胞的重疊和粘連等原因會影響細胞的識別，給定量分析帶來困難。

2.4 T細胞與DC的接觸時間

細胞的接觸時間是研究動態相互作用的重要特征，T細胞與DC的接觸時間可能影響免疫功能，因其限制了MHC II類-肽復合物的數量[10]。Volocity軟件識別視野內有61個T細胞，其中22個與DC接觸，其余細胞處于流動狀態。64%(14/22)接觸時間＞400 s。接觸時間包括連續接觸時間和間歇性接觸時間累加，結果顯示，長時間接觸是DC和T細胞作用的主要方式，更易促進突觸的形成，加速免疫反應發生(如圖4所示)。

圖4 T細胞與DC接觸時間柱狀圖

2.5 T細胞與DC的接觸方式

通過三維成像對細胞突觸類型進行分類，可分為未接觸、松散接觸和緊密接觸(如圖5所示)。

圖5 三維分析T細胞與DC的接觸方式示圖

圖5a和c呈現的是三維和二維成像的緊密接觸，DC膜發生明顯的凹陷，二維圖像可觀察到DC凹陷弧度，而圖5b和d松散接觸時未觀察DC明顯的形變。由此可知，不同T細胞與DC間的相互作用力也存在非常明顯的差別，形成的突觸類型不同，進而可能影響后續免疫反應的強弱。

2.6 T細胞與DC的接觸體積

在研究細胞間存在緊密連接和松散連接的基礎上，進而研究細胞的接觸體積(如圖6所示)。

圖6 Volocity分析和定量T細胞與DC接觸體積示圖

圖6顯示，T細胞與DC發生明顯的接觸，最大接觸體積為192 μm3。隨著時間的延長，接觸體積發生不規則的變化，T細胞與DC形成的突觸是一個動態的結構。同時發現在30 min內形成免疫突觸未消失，可能會啟動后續的免疫反應。因此，對突觸結構、形成過程及功能的進一步研究，將會更深入了解如何啟動獲得性免疫應答[19]。

3 討論

本研究詳細表征了T細胞與DC的動態相互作用，建立了系統表征兩種細胞相互作用的方法，對細胞形態變化、運動軌跡、接觸時間、接觸方式和接觸體積進行了總結，故該研究分析方法經過改進后可以應用于其他研究領域。T細胞與DC的動態相互作用是免疫研究的重要內容，T細胞與DC持續性的相互作用不僅是免疫反應的一個結果，更是自身的一個關鍵性的決定因素，短時間相互作用的特征是T細胞對抗原的識別，長時間相互作用將導致突觸形成，但是目前大部分實驗結果是通過流式細胞儀和免疫組化完成，缺少對這兩種活細胞系統的動態表征方法[10]。

目前，市場上的分析軟件主要有：Retrac，CellTrack，ImageJ，Imaris及Volocity等圖像分析軟件，這些軟件由于分割方法、跟蹤方式、運行平臺以及輸出類型等不同而分別應用于不同的研究領域[20]。其中高性能的Volocity特別適用于三維圖像分析，且Volocity圖像分析軟件不僅可用于圖像獲取系統的圖片分析，還支持市場上約90%圖像獲取平臺獲得的圖片分析[5]。但是Volocity存在許多定量上的錯誤，如細胞不規則、熒光強度低、細胞密度高以及細胞重疊等都是Volocity分析產生誤差的原因，因此使用Volocity分析結果時，需在實驗前詳細了解實驗步驟以及準確的參數設置，減少不必要的誤差，以獲得相對準確的實驗結果。

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