人牙周膜成纖維細胞的生物力學研究

張春艷，郭大偉，宋玲，劉文，于江波，袁曉

山東省青島市市立醫院口腔醫療中心，山東青島266071

人牙周膜成纖維細胞的生物力學研究

張春艷，郭大偉，宋玲，劉文，于江波，袁曉

山東省青島市市立醫院口腔醫療中心，山東青島266071

人牙周膜成纖維細胞是牙周膜中的主要細胞，參與調節牙周組織的改建和再生。臨床上咬合創傷、正畸治療及各種修復體行使功能時，各種作用力通過牙體傳遞到牙周，引起牙周膜的一系列生物學改變。因而作為牙周膜的主要功能細胞—牙周膜成纖維細胞（Human Periodontal liqament Fibroblasts，hPDLFs）的體外生物力學研究，對臨床治療起著重要的指導意義。該研究從hpDLFs的生長特征、蛋白質合成、標志性酶及細胞因子、信號轉導方面對目前的hpDLfs的生物力學研究做一綜述。

牙周膜成纖維細胞；生物力學；研究

人牙周膜成纖維細胞是牙周膜中的主要細胞，該細胞具有合成降解膠原，受誘導多向分化的能力，而且還通過合成分泌多種因子與酶,參與調節牙周組織的改建和再生。臨床上咬合創傷、正畸治療及各種修復體行使功能時，各種作用力通過牙體傳遞到牙周，引起牙周膜的一系列生物學改變。因而作為牙周膜的主要功能細胞—牙周膜成纖維細胞（Human Periodontal liqament Fibroblasts，hPDLFs）的體外生物力學研究，對臨床治療起著重要的指導意義。該研究從hpDLFs的生長特征、蛋白質合成、標志性酶及細胞因子、信號轉導方面對目前的hpDLfs的生物力學研究做一綜述。

1 hPDLFs的生長增值

加載裝置的不同、應用大小、應力頻率的不同，hPDLFs增殖活性的改變也不盡相同。王永等[1]對hPDLFs施加機械牽張力，結果發現一定力值范圍的機械張力能促進hPDLFs增殖活性，過大力值的牽張力反而抑制細胞增殖。周繼祥等[2]利用自行設計的膜式動態張應力-體外細胞研究體系對hPDLFs分別進行靜張應力及不同頻動范圍動態張應力加載，結果發現不同張應力對hPDLFs的增值活性影響明顯不同，靜張應力有明顯的促hPDLFs增值作用而動態張應力有一定的抑制作用。體外加力時間的不同[3]，同樣也影響到細胞的增殖，在一定時間范圍內，周期性張應力可促進hPDLFs的增殖，但隨著時間的延長，增殖會受到抑制。在眾多研究中，加力方式、加力大小、加力時間的不同，均會引起hPDLFs增殖或抑制等不同的變化，牙周膜受力的復雜性決定了體外模擬實驗的多樣性。

2 hPDLFs膠原纖維及蛋白質合成

人牙周膜成纖維細胞具有合成、分泌膠原蛋白功能，其膠原纖維合成情況可以反映牙周膜細胞外基質的新陳代謝。Howard等[4]研究發現5%的拉伸應變條件下，I型膠原合成增加而10%應變則無明顯影響，說明hPDLFs對不同的機械力刺激產生不同的反應，從而影響了細胞外基質的合成，以適應外力的刺激。同樣趙志河[5]研究發現不同頻動范圍的動態張應力對hPDLFs膠原纖維合成的影響截然不同，適當頻動范圍的動態張應力更有效的促進膠原纖維的合成而靜態張應力作用并不能增加hPDLFs的膠原纖維合成。2種作用力對膠原纖維合成影響差異可能是導致細胞形變的不同引起的[6]。對體外培養的hPDLFs施以動態張應力，較小的張應力使hPDLFs纖連蛋白mRNA表達隨加力時間延長逐漸增加，較大張應力使hPDLFs纖連蛋白表達先增加后減少[7]。體內環境下膠原纖維和蛋白是細胞外基質的重要組成部分，hPDLFs受力時，細胞外基質會產生相應的破壞和改建，并通過膜蛋白傳導到細胞內。

3 hPDLFs的細胞因子及酶

堿性磷酸酶（alkalline phosphates,ALP）是參與骨組織鈣化過程中關鍵性蛋白酶。Alp活性較高則表示該組織具有較強的鈣化及成骨功能。PDLFs具有較高水平的ALP活性，其堿性磷酸酶活性是牙齦成纖維的10倍。Yamaguchi M[8]等研究發現人牙周膜細胞在在同期性外力的作用下（24%elongation），ALP活動顯著降低，并且發現ALP活性的降低主要靠PGE2和IL-1調節的。張宇[9]等利用液壓加載系統對hPDLFs施加壓力發現，hPDLFs對壓力具有一定的耐受性，但當壓力增加到一定程度時，隨著作用時間延長造成ALP活性降低，壓力較大會短時間內造成ALP活性降低運以說明過大的咬合力或矯治力，將會影響ALP活性降低，影響牙周組織鈣化，并導致牙周組織的一系列病變。

牙周膜細胞是具有異質性的細胞群，受到刺激或加入某些誘導條件下，細胞會分化成具有成骨特性的細胞，從而引起牙槽骨的吸收和形成。hPDLFs是正畸牙移動過程中受力的直接效應細胞，因而在牙槽骨改建中起著關鍵的作用。骨橋蛋白（osteopontin,OPN）是基質礦化的調節基因，OPNmRNA在成骨細胞分化的早期即開始表達，可以作為成骨樣細胞分化的早期標志。骨鈣素(osteo calcin,OC)是細胞外基質蛋白，它是成骨細胞成熟的標志。研究發現，hPDLFs在受到機械牽張力刺激作用下，OPN和OC均增殖，提示hPDLFs在機械力誘導下向成骨樣細胞分化，從而在機械力介導的牙槽骨改建中發揮重要的作用[10-11]。

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMP）是一類水解基底膜和細胞外基質的蛋白水解酶家族。MMP通過降解膠原而參與牙周組織的力學改建。彭庭莉[12]等對hPDLFs施加動態張應力，觀察其MMP的分泌情況，結果發現hPDLFs受到動態張應力作用后MMP-9表達有不同程度的增加，當細胞受到5KpaN-0-N5Kpa動態作用力后表達明顯增加。該結果提示，恰當的張應力作用可以明顯促進MMP-9生成，從而加速牙周膜的改進，這對臨床選擇最適矯治力提供了可靠的依據。MMP-2能降解IV型膠原纖維，該纖維是基底細胞膜的主要成分。正畸過程中，牙周組織吸收和重建，MMP-2起著重要的作用。對hPDLFs施加持續機械張應力可誘導MMP-2表達的增加，從而影響牙周細胞外基質的代謝[13]。

在機械力刺激下，hPDLFs能夠合成并分泌多種細胞因子，從而調節參與了牙周組織的改建和修復。TGF-β1作為損傷修復過程中的重要生物介質，對牙周軟硬組織再生修復都有重要作用。TGF-β1能促進hPDLFs的增殖，能促進蛋白質和RNA的合成[14]，還能促進hPDLFs產生細胞外基質，因而研究外力作用對hPDLFs的TGF-β1表達的影響，具有極其重要的意義。湯楚華等[15]采用液壓細胞加載裝置對hPDLFs施加不同等級的壓力，結果發現，hPDLFs合成TGF-β1受到機械壓力的調控，在一定載荷范圍內，hPDLFs合成TGF-β1量隨著壓力增大而降低。該研究提示機械壓力可能通過對hPDLFs的TGF-β1表達的影響，調節細胞的增殖、細胞外基質的降解過程，從而引起牙周組織的改建。Kimoto S[16]等應用Flexercell細胞拉伸裝置，對hPDLFs施加5%的拉伸應變，每分鐘3次，結果發現恒牙來源的hPDLFs的TGF-β1合成顯著增多hPDLFs，表明hPDLFs在外力作用下通過合成分泌細胞因子的參與了牙周組織的改建。

4 信號轉導途徑

無論在臨床正畸過程中還是咬合創傷時，外力的刺激傳導到牙周膜的hPDLFs，引起牙周膜的一系列改建。力學信號是如何傳導致效應細胞呢？這就涉及到機械力學信號傳導路徑的問題。多種生物化學信號參與了正畸力下牙槽骨改建。

絲裂原活化蛋白激酶級聯（mitogen actirated protein Kinase,MAPK）是細胞內主要的傳導系統。MAPK信號傳導系統有多條信號通道，p38MAPK是比較經典的一條。當受到外界刺激時，細胞內p38MAPK由非磷酸化轉為磷酸化狀態而活化，它可促進下游底物的磷酸化來快速實現信號的傳遞，也可以通過轉位入胞核活化轉錄因子調控特殊基因的表達，從而將信號從胞外傳導到胞核。黨平等[17]應用可控壓力細胞加載裝置，觀察壓力作用下hPDLFs內p38MAPK激活的強度變化，結果發現當壓力值為200 Kpa時，細胞內p38MAPK磷酸化程度明顯增強，約60min后磷酸化水平降至刺激前水平，初步證明機械力信號可通過跨膜轉導激活p38MAPK，引起牙周膜細胞

功能改變，導致牙周組織改建。對hPDLFs施加周期性張應力時發現，加入p38MAPK特異性抑制劑可抑制hPDLFs細胞增殖，并能抑制周期性張應力引起的增殖細胞核抗原mRNA的表達，證明p38MAPK信號通道在周期性張應力介導的hPDLFs增殖中發揮重要的作用[4]。

細胞外信號調節激酶ERK（extracellular sigal-regulated kinase）信號通路是另一條重要的MAPK信號轉導途徑。Kook SH等研究發現機械力通過促進骨保護素的產生而抑制hPDLFs向破骨細胞的轉化，ERK信號通路參與其中[18]。ERK1/2是ERK的活性形式，可進入細胞核，通過磷酸化活化轉錄因子，調控細胞增殖和分化。有研究發現，ERK1/2信號通路介導機械力作用下hPDLFs的增殖調控及促進BMP-2的表達[19]。

RAS同源基因(Ras homologgene,Rho)是細胞骨架的主要組成成分，可以調節肌動蛋白應力纖維，通過激活Rho相關螺旋卷曲蛋白激酶等一系列反應，在應力介導hPDLFs細胞骨架重排中發揮作用。hPDLFs受到正畸力的作用后，會發生細胞骨架的重排和轉移，從而對應力產生反應。Rock是Rho家族的下游信號分子，研究發現[20]，周期性張應力作用下ROCK蛋白的表達增強，Rock的特異性抑制劑可以降低其表達和細胞骨架的重排，從而推斷周期性張應力促進細胞骨架的重排中Rho信號通路參與了此過程。

磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（PKB或Akt）信號通路是調控細胞增殖、凋亡的重要信號轉導通路之一。PI3K與相應的配體（如生長因子）結合后能發生自身酪氨酸殘基的磷酸化，能磷酸化細胞膜上的PKB，激活Akt,調控許多細胞與細胞代謝、凋亡、增殖有關的蛋白，從而發揮抗細胞凋亡的作用。研究發現[21]PI3K/Akt信號通路參與了張應力介導的hPDLFs細胞的凋亡。

總之，hPDLFs的體外生物力學研究雖有大量的報道，但由于多方面的原因，出現的結果不盡相同。比如，在細胞的來源方面，有利用組織塊法培養的牙周膜細胞，有的是酶消化法培養的，還有的利用傳代的牙周膜成纖維細胞珠。細胞加載裝置也不盡相同，所以施力的標準不同，施力的方式不同，研究結果自然有一定的差異。該研究認為應選用最具有代表性的細胞株來研究，選用與臨床上合力或正畸力最接近的力學加載裝置，研究的結果才更有利用價值。

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R78

A

1672-5654（2015）08（c）-0195-04

10.16659/j.cnki.1672-5654.2015.24.195

2015-05-25）

張春艷（1977.9-），女，山東青島人，碩士學位。

袁曉，男，博士后，主任醫師。