轉NAT3基因水稻氮素利用效率分析

查中萍，萬丙良，杜雪樹，殷得所，戚華雄

摘要：對海洋硅藻硝酸鹽轉運蛋白NAT3編碼基因的單拷貝插入轉基因水稻純系進行熒光定量PCR檢測，獲得NAT3基因的超表達株系。NAT3超表達株系中硝酸還原酶基因OsNR1的轉錄較非轉基因對照中花11顯著增強。對超表達株系及對照中花11進行不同氮素濃度的培養和栽培試驗。結果表明，在低氮培養基培養條件下，轉NAT3基因水稻的幼苗干重較中花11高;在低氮盆栽條件下，轉NAT3基因超表達株系的葉綠素含量、生物學產量和植株的含氮量均較相同氮素條件下的中花11高，說明NAT3基因超表達能提高轉基因水稻在低氮條件下的氮素利用效率，促進水稻生長。

關鍵詞：轉基因水稻;硝酸鹽轉運蛋白;氮素利用效率

中圖分類號：S511 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）23-5653-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.009

水稻是我國主要的糧食作物，種植面積占糧食作物總面積的27%，產量占糧食總產的44%[1]。長期以來，水稻育種多以高產、耐肥抗倒作為主要育種目標，因為追求高產導致氮肥施用量大幅度增加[2]。大量氮肥的使用不僅提高了水稻的種植成本，導致增產不增收，而且還帶來水體硝酸鹽污染的潛在危險，對生態環境和人類健康產生極為不利的影響[3]。由于氮肥利用率的下降，氮肥過量施用造成的環境負效應也越來越引起廣泛關注[4-8]。因此，通過遺傳改良提高水稻品種的氮素吸收利用能力，降低氮肥使用量是發展水稻生產急需解決的重要問題。

水稻根系對土壤中氮素的吸收是決定水稻氮素利用效率的前提。硝酸鹽是植物可直接利用的主要氮源之一，植物對硝酸鹽的吸收主要依靠硝酸鹽轉運蛋白完成。深海硅藻硝酸鹽轉運蛋白基因與氮具有高度親和性，在低氮環境下轉錄水平顯著升高，可使硅藻從硝酸鹽濃度極低的海水中富集硝酸鹽[9]。NAT3是劉昱輝等[10]從深海硅藻中克隆的一個硝酸鹽轉運蛋白基因，通過農桿菌介導的遺傳轉化方法，將NAT3基因導入水稻品種中花11，獲得了NAT3基因的轉基因植株[11]。本研究通過熒光定量PCR對轉基因水稻中NAT3基因表達量進行分析，獲得NAT3基因超表達純系，并進一步通過不同氮濃度的培養基培養及盆栽試驗，測定轉基因水稻與對照受體材料中花11的生長量及植株含氮量，并分析NAT3基因的表達對轉基因水稻的氮素利用率的影響，為應用轉基因技術培育氮肥高效利用水稻提供理論依據。本研究對減少水稻生產中的氮肥施用量、節約水稻生產成本、降低環境污染、促進農業高效節能可持續發展具有重要意義。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗材料

本試驗轉基因株系是以中花11為受體的轉NAT3基因T4代單拷貝插入純系[11]。非轉基因水稻對照材料為中花11，由湖北省糧食作物種質創新與遺傳改良重點實驗室繁殖保存。

1.2 ?NAT3基因及硝酸還原酶基因OsNR1表達量的測定

取三葉一心期的水稻幼苗（包括根），利用Trizol試劑抽提總RNA，通過瓊脂糖凝膠和紫外分光光度計測定RNA質量和濃度。取5 μg RNA反轉錄酶合成單鏈cDNA，采用Roche公司的定量檢測試劑盒FastStart Universal SYBR Green Master （Rox）進行定量PCR分析，內標基因為actin基因。引物由Invitrogen中國公司合成。擴增體系25 μL，其中12.5 μL 2× qPCR Mix ，2.0 μL引物，2.5 μL反轉錄產物，8.0 μL ddH2O 。擴增程序為預變性95 ℃，10 min;95 ℃變性15 s， 58 ℃下退火20 s，72 ℃下延伸20 s， 40 次循環;72 ℃延伸5 min。采用ΔΔCT法進行結果處理。

1.3 ?不同氮濃度培養基上轉NAT3基因水稻幼苗的生長狀況測定

NAT3基因超表達株系及對照中花11的成熟胚經消毒后，于MS培養基上獲得無菌苗，選取生長狀況一致的幼苗，去除胚乳后移栽到1/2MS、1/4MS、1/8MS 3個不同氮濃度的培養基上（1/2MS、1/4MS、1/8MS表示MS培養基中大量元素中的氮素減半，其余成分不變）。每個處理種植5株，40 d后取樣，測定各處理5個植株的整株干重。

1.4 ?轉NAT3基因水稻盆栽試驗

盆栽基土為含氮量低的黃棕壤，堿解氮含量74.57 mg/kg。曬干后稱取8 kg/（盆·干土），分別按不同氮素處理加入相應的營養元素。盆栽試驗氮肥處理濃度設計如表1所示，在施用相同磷、鉀肥的基礎上，設4個氮素處理，分別為全氮（1N）、1/3氮（1/3N）、1/6氮（1/6N）、不施N肥（0N，空白對照），分基肥、分蘗肥和抽穗肥三期施用。NAT3基因超表達株系及對照中花11種子在育秧盤中播種，至四葉一心時選取生長一致的幼苗移栽，每盆種植4株，每個氮素處理種植6盆。抽穗期取3盆植株進行葉片葉綠素含量。成熟后另外3盆收獲整個植株（包括根系），烘干后測定生物學產量和含氮量。

1.5 ?葉綠素含量測定

抽穗期取倒二葉片，每個處理取3個葉片，每個葉片測定2次。參考文獻[12]測定葉綠素含量。

1.6 ?水稻植株含氮量及生物學產量測定

收獲轉基因株系及對照水稻整個植株（包括根系），洗凈烘干后稱重待測。用凱氏定氮法測定植株含氮量。

2 ?結果與分析

2.1 ?轉基因株系中NAT3基因及硝酸還原酶基因OsNR1的表達

不同轉基因株系中NAT3和OsNR1基因的轉錄表達情況如圖1所示。10個轉基因株系中有8個株系的NAT3基因有不同程度的轉錄表達，其中T4-1、T4-2及T4-3的NAT3基因轉錄量較高，而株系T4-9、T4-10及非轉基因對照中花11中無NAT3基因轉錄。OsNR1基因在株系T4-1、T4-2及T4-3中有較高的表達量，高于在其他轉基因株系與中花11中的表達量。OsNR1基因在不同轉基因株系中的表達趨勢與NAT3基因的表達趨勢基本一致。同中花11相比，株系T4-1、T4-2及T4-3中OsNR1的轉錄顯著增強。結果說明，NAT3基因整合到水稻基因組中后，能夠正常表達，而且其超表達促進了下游硝酸還原酶OsNR1基因的表達。選擇NAT3和OsNR1基因表達量高的轉基因株系T4-1、T4-2及T4-3進行后續試驗研究。

2.2 ?不同氮濃度培養基上NAT3基因超表達株系幼苗的生長狀況

在不同氮濃度培養基上生長的轉基因株系T4-1、T4-2、T4-3及對照中花11幼苗的干重結果如表2所示。由表2可知，在1/2MS、1/4MS、1/8MS 3種氮濃度培養基上，3個轉基因株系40 d齡幼苗的干重均高于非轉基因對照中花11的幼苗干重，其中在1/4MS和1/8MS培養基上轉基因株系的幼苗干重與對照之間的差異達極顯著水平（P<0.01）。結果表明，同對照相比，轉基因水稻幼苗在低氮環境下的生長速度快于非轉基因對照。

2.3 ?NAT3基因超表達水稻葉綠素含量分析

不同氮素營養條件下，轉基因株系及非轉基因對照中花11抽穗期倒二葉葉綠素含量如表3所示。由表3可知，隨著氮素使用量的降低，NAT3基因超表達株系及中花11的葉片葉綠素a和葉綠素b含量均有不同程度的下降;在1/3N、1/6N及0N處理條件下，轉基因株系葉綠素a含量較對照中花11高，但無顯著差異（P<0.05）;T4-3在1/3N、1/6N和0N的低氮條件下的葉綠素b含量均顯著（P<0.05）高于對照中花11。結果表明，在低氮環境下NAT3基因超表達株系葉綠素含量較對照有所增加，其中株系T4-3中葉綠素b含量顯著高于非轉基因對照。

2.4 ?NAT3基因超表達水稻植株含氮量及生物學產量

不同氮素營養條件下，NAT3基因超表達株系和非轉基因對照中花11的含氮量和生物學產量結果如表4所示。由表4可知，轉基因株系在1/3N、1/6N的條件下，其植株的生物學產量和含氮量均高于對照，其中T4-1株系在1/3N、1/6N的低氮條件下，其生物學產量和含氮量較對照的差異均達顯著水平（P<0.05）;T4-3株系在1/3N、1/6N低氮條件下的生物學產量較對照的差異達極顯著水平（P<0.01）。說明NAT3基因的超表達能提高水稻對氮肥的利用效率，提高植株含氮量和生物學產量。

3 ?小結與討論

硝態氮（NO3-）是植物吸收利用的主要氮源之一。硝酸鹽轉運蛋白是植物硝酸鹽轉運系統的重要組成部分，分為低親和性和高親和性兩類。大量研究已經證明，高親和性硝酸鹽轉運系統主要負責低NO3-濃度時植物氮的吸收[13-15]。硝酸鹽轉運蛋白基因NRT2.1缺失突變的擬南芥喪失75%的高親和性硝酸鹽轉運系統活性[16，17]，因此導致在以NO3-為惟一氮源的低氮環境下不能正常生長[18]。然而通過在植物中超表達高親和性硝酸鹽轉運蛋白基因改變植物的氮素利用效率的研究鮮有。Fraisier等[19]在煙草中超表達高親和性硝酸鹽轉運蛋白基因NpNRT2.1，結果表明，不論環境中提供的NO3-濃度水平如何，轉基因煙草和野生型對照中的NO3-含量無顯著差異。

本研究中，NAT3基因在水稻中超表達后，促進了硝酸還原酶OsNR1基因的表達。在低氮條件下，轉基因植株的含氮量較非轉基因對照高，表明NAT3基因的超表達在低氮環境下促進了氮的吸收。在正常氮水平條件下，NAT3基因的超表達并不能促進氮的吸收。這是因為NAT3屬于高親和性的硝酸鹽轉運系統，轉錄后調控使其主要在低氮環境下起作用[20]。同轉NAT3基因水稻在低氮環境下的氮素吸收效率增強一致，在低氮環境下轉NAT3基因水稻的生物學產量和葉片葉綠素含量較非轉基因對照均有所提高。但轉NAT3基因水稻在低氮環境下的氮素含量、葉片葉綠素含量和生物學產量均低于正常環境下的相應指標，說明，轉NAT3基因水稻在低氮環境下的氮素吸收效率雖然有所提高，但在本試驗所設置的低氮條件下仍未達到滿足水稻正常生長發育所需的水平。

中國的水稻氮肥施用量占全球水稻氮肥施用量的37%，氮肥利用率遠遠低于全球的平均水平[21]。過量施用氮肥導致環境污染，也增加了農民的水稻種植成本。本研究獲得的硝酸鹽轉運蛋白NAT3轉基因水稻在低氮環境下的氮素吸收效率高于非轉基因對照，為利用生物技術提高水稻的氮素利用效率、減少氮肥的過量使用提供了有效的技術途徑。

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