煙草重要基因篇：7.煙草多藥和有毒化合物排出基因

張艷艷，王 倩，劉貫山

（中國農業(yè)科學院煙草研究所，青島 266101）

多藥和有毒化合物排出（multidrug and toxic compound extrusion，MATE）基因編碼的蛋白是一類依靠Na+/H+跨膜電化學勢轉運底物的次級轉運蛋白，對金屬離子、次級代謝產物、抗生素及多種藥物有轉運作用。MATE是一個多基因家族，該家族成員最先在細菌中報道，此后真菌、動物和植物中也陸續(xù)有MATE基因得到鑒定。植物MATE家族成員主要參與金屬離子、毒素物質和次級代謝產物的運輸，進而在抗逆和毒素解毒中發(fā)揮作用；部分成員參與生長素的生物合成，調節(jié)植物的生長發(fā)育進程。

1 植物MATE基因家族及其功能

1.1 真核生物轉運蛋白家族

生物的解毒機制主要包括氧化降解、固定化、水解反應、轉化作用以及代謝排出體外等。其中，將自身代謝或外界產生的有毒物質排出體外是一種有效的解毒機制。研究表明，高等真核生物中該過程主要涉及三類轉運蛋白家族：ATP結合盒(ATP-binding cassette，ABC)超家族、主要促進因子超家族(major facilitator superfamily，MFS)和MATE家族[1]。ABC超家族又可分為ABCB、ABCC、ABCG三個亞家族,分別參與植物生長素的極性運輸調節(jié)[2]、囊泡運輸[3-4]和植物自身的抗性保護等[5-6]。MFS超家族是一類典型的次級轉運蛋白，利用H+滲透勢能轉運底物[7]，主要參與植物對營養(yǎng)物質及金屬離子的轉運吸收[8-9]。相較于MFS超家族和ABC超家族，人們對MATE家族的了解較晚。1998年，Morita等[10]鑒定到一個新的轉運蛋白，由于其與MFS家族類似，均含有12個跨膜區(qū)域，人們最初把這一類蛋白劃入MFS家族中。后來的研究表明，這類蛋白與 MFS蛋白序列同源性很低，保守域也不相同，因此被劃分到一個新的家族中，命名為多藥和有毒化合物蛋白家族，即MATE家族。隨著研究的深入，越來越多的MATE家族成員被鑒定出來。依據其序列相似性及親緣關系的遠近，已經鑒定到的約900個MATE家族蛋白又可分為三個亞類：NorM亞類、DinF亞類和真核亞類[11]。其中，NorM、DinF亞類為H+/Na+勢驅動，真核亞類則全部為H+勢驅動。

1.2 植物MATE家族

目前已知的植物MATE家族成員大部分屬于真核亞類。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中預測到56個MATE家族基因[12]。這些基因根據系統(tǒng)進化關系大致可以分為5個簇，除第三簇為8-13個跨膜區(qū)外，其它簇均為12個跨膜區(qū)。在水稻（Oryza satviva）中預測到53個MATE基因[13]。

1.3 植物MATE基因的功能

目前對擬南芥MATE基因的研究相對深入，56個MATE基因中已有9個得到功能鑒定。水稻中也已鑒定出6個MATE基因[14]。這些基因的功能大致可分為三個方面：（1）轉運生物堿、類黃酮、花色素苷等次級代謝產物和四甲胺、溴化乙錠等毒素物質。如AtTT12[15]、AtDTX1[12]、AtFFT等[16]，此類蛋白一般定位于質膜或液泡膜，在次級代謝物、毒素物質的液泡封裝和細胞外排中發(fā)揮作用。（2）參與水楊酸介導的Fe3+、Al3+、Zn2+等金屬離子的轉運。這類蛋白包括AtEDS5[17]、FRD類MATE成員(AtFRD3[18]、OsFRDL1[19]、OsFRDL4[20])、HvAACT1[21]等。（3）參與植物生長素的生物合成過程。在擬南芥激活標簽插入突變群體中鑒定到一個株型明顯改變的突變體adp1[22]，該突變體具有株高矮、側枝數目增多、蓮座葉數目增多和頂端優(yōu)勢不顯著的表型。后續(xù)分析表明，該突變表型為MATE家族基因ADP1（At4g29140）的過量表達所致。ADP1定位于內質網膜上，參與生長素的生物合成過程，過表達該基因引起植株生長素含量下降。擬南芥中與ADP1同屬一個亞家族的其他7個MATE基因（At1g58340、At4g23030、At5g52050、At5g19700、At2g38510、At1g71870、At5g49130）的過量表達均能不同程度地產生該突變表型，推測該亞家族成員可能具有相似的功能。

普通煙草（Nicotiana tabacum）、苜蓿（Medicago truncatula）、大麥（Hordeum vulgare）、高粱（Sorghum bicolor）中也有少量MATE基因的功能得到研究。

2 煙草MATE基因家族及其功能

2.1 煙草MATE基因家族

中國農業(yè)科學院煙草研究所利用茄科植物數據庫中普通煙草的基因組信息，對該物種的MATE家族成員進行了基因組水平預測。預測結果表明，普通煙草MATE基因數目為131個，約為擬南芥的兩倍。相似性極高的同源基因往往成對出現,分析其應為來源于絨毛狀煙草（Nicotiana tomentosiformis）和林煙草（Nicotiana sylvestris）的直系同源基因。目前，普通煙草中共鑒定四個MATE基因，它們分別是NtMATE1、NtMATE2、Nt-JAT1和Nt-JAT2。

2.2 煙草MATE參與煙堿等生物堿的轉運過程

植物在其生命周期中會合成多樣的次級代謝產物以抵御外界環(huán)境脅迫對自身的傷害。作為煙草的重要次級代謝產物，煙堿可以在一定程度上抵御病原菌和昆蟲對植株的侵害[14]。煙堿主要在煙草根部合成，通過木質部向上運輸至葉肉細胞的液泡中發(fā)揮作用[23-24]。煙草體內多種轉運蛋白相互協(xié)調參與該過程，以確保植株本身不受煙堿的毒害。現已證明，普通煙草中至少有四個MATE基因（NtMATE1、NtMATE2、Nt-JAT1、Nt-JAT2）參與到該過程中,其表達均受到損傷相關誘導激素-茉莉酸甲酯的強烈誘導。NtMATE1和NtMATE2是一對來源于絨毛狀煙草和林煙草的直系同源基因，它們在根中特異表達。其表達除受茉莉酸甲酯誘導外，還受內、外源煙堿誘導。相較于野生型植株，兩基因的RNAi干擾植株對煙堿脅迫更為敏感。轉NtMATE1、NtMATE2基因的酵母細胞具有較高的尼古丁轉運活性。亞細胞定位顯示，NtMATE1定位于液泡膜中，分析其主要參與煙堿合成后的液泡封存過程[25]。Nt-JAT1基因在根、莖、葉中都有表達。該基因可以轉運煙堿、小檗堿等內外源生物堿，但不能轉運黃酮類物質。Nt-JAT1在不同組織中的亞細胞定位結果不同：在葉中，該基因定位于液泡膜；在根部，該基因定位于質膜。結合該蛋白耦合H+轉運底物，且細胞質pH值高于質外體和液泡的情況，推測該基因在根部參與煙堿的細胞外排過程，在葉中參與煙堿的液泡封存過程[26]。Nt-JAT2基因在野生型植株中表達量很低，只在葉中微量表達。茉莉酸甲酯能顯著提高該基因在葉中的表達。亞細胞定位結果顯示，該基因定位于液泡膜。在茉莉酸甲酯響應的脅迫誘導下，該基因表達量的提高可加速葉肉細胞中液泡對煙堿的積累，進而提高植株的抗性[14]。

除煙草外，其它植物中也鑒定到一系列具有轉運生物堿功能的MATE基因。擬南芥AtDTX1對黃連素、小檗堿等生物堿有轉運作用[12]。黃連液泡膜上的MATE蛋白參與黃連素的運輸[27]。

2.3 煙草MATE參與植株生長素的合成過程

中國農業(yè)科學院煙草研究所在煙草激活標簽插入突變群體中鑒定到兩個具有相似表型的突變株系，它們均具有株高矮、葉節(jié)間距短、早花等突變表型。進一步分析表明，盡管兩個突變株系的激活標簽插入位置不同，但激活標簽的一側均存在一個MATE家族基因，且這兩個基因與擬南芥ADP1基因同屬于一個亞家族。表達分析結果表明，突變株系中 MATE基因表達量明顯升高。由此推測，這兩個煙草中的 MATE基因也有可能參與生長素的生物合成過程。

3 問題與展望

煙草作為一種特殊的嗜好性作物，其體內次級代謝物質的含量對品質及經濟價值有重要影響。同時，植物MATE家族基因對次級代謝物質的運輸、轉運和積累發(fā)揮不可忽視的作用。因此，研究煙草中該家族基因具有重要的理論價值和實踐意義。與擬南芥和水稻相比，煙草中得以鑒定的MATE基因數目較少，且功能主要集中在煙堿轉運方面,人們對該家族功能的了解非常有限。隨著煙草全基因組測序的完成和功能基因組學的開展，將有更多煙草MATE家族成員的功能及調控機制逐步被闡明，部分MATE基因可能會在新型煙制品煙葉原料的品種選育工作中發(fā)揮重要作用。

[1]Omote H, Hiasa M, Matsumoto T, et al.The MATE proteins as fundamental transporters of metabolic and xenobiotic organic cations[J].Trends Pharmacol Sci, 2006, 27(11): 587-593.

[2]Kaneda M, Schuetz M, Lin B S, et al.ABC transporters coordinately expressed during lignification of Arabidopsis stems include a set of ABCBs associated with auxin transport[J].J Exp Bot, 2011, 62(6): 2063-2077.

[3]Lu Y P, Li Z S, Drozdowicz Y M, et al.AtMRP2, an Arabidopsis ATP binding cassette transporter able to transport glutathione S-conjugates and chlorophyll catabolites: functional comparisons with Atmrp1[J].Plant Cell, 1998, 10(2): 267-282.

[4]Klein M, Geisler M, Suh S J, et al.Disruption of AtMRP4, a guard cell plasma membrane ABCC-type ABC transporter, leads to deregulation of stomatal opening and increased drought susceptibility[J].Plant J, 2004, 39(2): 219-236.

[5]Jasinski M, Stukkens Y, Degand H, et al.A plant plasma membrane ATP binding cassette-type transporter is involved in antifungal terpenoid secretion[J].Plant Cell, 2001, 13(5): 1095-1107.

[6]Krattinger S G, Lagudah E S, Spielmeyer W, et al.A putative ABC transporter confers durable resistance to multiple fungal pathogens in wheat[J].Science, 2009, 323(5919): 1360-1363.

[7]孫林峰, 王佳偉, 顏寧.MFS超家族轉運蛋白結構與分子機制的研究[J].生命科學，2011，23（11）：1052-1056.

[8]Haydon M J, Cobbett C S.A novel major facilitator superfamily protein at the tonoplast influences zinc tolerance and accumulation in Arabidopsis[J].Plant Physiol, 2007, 143(4): 1705-1719.

[9]Remy E, Cabrito T R, Batista R A, et al.The Pht1;9 and Pht1;8 transporters mediate inorganic phosphate acquisition by the Arabidopsis thaliana root during phosphorus starvation[J].New Phytol, 2012, 195(2): 356-371.

[10]Morita Y, Kodama K, Shiota S, et al.NorM, a putative multidrug efflux protein of Vibrio parahaemolyticus and its homolog in Escherichia coli[J].Antimicrob Agents Chemother, 1998, 42(7): 1778-1782.

[11]Lu M, Radchenko M, Symersky J, et al.Structural insights into H+-coupled multidrug extrusion by a MATE transporter[J].Nat Struct Mol Biol, 2013, 20(11): 1310-1317.

[12]Li L, He Z, Pandey G K, et al.Functional cloning and characterization of a plant efflux carrier for multidrug and heavy metal detoxification[J].J Biol Chem, 2002, 277(7): 5360-5368.

[13]Tiwari M, Sharma D, Singh M, et al.Expression of OsMATE1 and OsMATE2 alters development, stress responses and pathogen susceptibility in Arabidopsis[J].Sci Rep, 2014, 4: 3964.

[14]Shitan N, Minami S, Morita M, et al.Involvement of the leaf-specific multidrug and toxic compound extrusion (MATE)transporter Nt-JAT2 in vacuolar sequestration of nicotine in Nicotiana tabacum[J].PLoS One, 2014, 9(9): e108789.

[15]Marinova K, Pourcel L, Weder B, et al.The Arabidopsis MATE transporter TT12 Acts as a vacuolar flavonoid/H+-antiporter active in proanthocyanidin-accumulating cells of the seed coat[J].Plant Cell, 2007, 19(6): 2023-2038.

[16]Thompson E P, Wilkins C, Demidchik V, et al.An Arabidopsis flavonoid transport is required for anther dehiscence and pollen development[J].J Exp Bot.2010, 61(2): 439-451.

[17]Nawrath C, Heck S, Parinthawong N, et al.EDS5, an essential component of salicylic acid-dependent signaling for disease eesistance in Arabidopsis, is a member of the MATE transporter family[J].Plant Cell, 2002, 14(1): 275-286.

[18]Rogers, E E.FRD3, a member of the multidrug and toxin efflux family, controls iron deficiency responses in Arabidopsis[J].Plant Cell, 2002, 14(8): 1787-1799.

[19]Yokosho K, Yamaji N, Ueno D, et al.OsFRDL1 is a citrate transporter required for efficient translocation of iron in rice[J].Plant Physiol, 2009, 149(1): 297-305.

[20]Yokosho K, Yamaji N, Ma J F.An Al-inducible MATE gene is involved in external detoxification of Al in rice[J].PlantJ, 2011, 68(6): 1061-1069.

[21]Zhou G, Delhaize E, Zhou M, et al.The barley MATE gene, HvAACT1, increases citrate efflux and Al3+tolerance when expressed in wheat and barley[J].Ann Bot, 2013, 112(3): 603-612.

[22]Li R, Li J, Li S, et al.ADP1 affects plant architecture by regulating local auxin biosynthesis[J].PLoS Genet, 2014, 10(1):e1003954.

[23]Naconsie M, Kato K, Shoji T, et al.Molecular evolution of N-methylputrescine oxidase in tobacco[J].Plant Cell Physiol, 2014,55(2): 436-444.

[24]Hashimoto T, Yamada Y.New genes in alkaloid metabolism and transport[J].Curr Opin Biotechnol, 2003, 14: 163-168.

[25]Shoji T, Inai K, Yazaki Y, et al.Multidrug and toxic compound extrusion-type transporters implicated in vacuolar sequestration of nicotine in tobacco roots[J].Plant Physiol, 2009, 149(2): 708-718.

[26]Morita M, Shitan N, Sawada K, et al.Vacuolar transport of nicotine is mediated by a multidrug and toxic compound extrusion(MATE) transporter in Nicotiana tabacum[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106(7): 2447-2452.

[27]Otani M, Shitan N, Sakai K, et al.Characterization of vacuolar transport of the endogenous alkaloid berberine in Coptis japonica[J].Plant Physiol, 2005, 138(4): 1939-1946.