NOD2信號對人肺泡巨噬細胞抗結核分枝桿菌活性的影響及機制研究＊

陽大慶，石麗萍，張普山

（1.湖南醫藥學院醫學檢驗系，湖南懷化418000；2.湖南醫藥學院藥學系，湖南懷化418000；3.廣東省人民醫院，廣東廣州510030）

結核病是由結核分枝桿菌所致的以呼吸系統感染為主的慢性傳染病。結核病是嚴重威脅著人類健康，同時也給社會帶來沉重負擔的疾病。目前，全世界現有結核病患者2 000萬，每年新發病例約900萬，每年死亡人數高達300萬，結核病防治的形勢非常嚴峻。我國是結核防治負擔最重的國家之一，結核病患病人數位居世界第2，僅次于印度，被世界衛生組織列為全球22個結核病高負擔國家之一，每年新發肺結核病患者145萬。尤其是耐藥性結核分枝桿菌的出現更使結核病的防治面臨巨大的挑戰，因此尋找新的抗結核桿菌感染的方法有著重要的意義。核苷酸結合寡聚化結構域2（NOD2）是一種胞內模式識別受體，屬于NOD樣受體（NLR）家族。現已證實，NOD2在炎性因子產生和抗銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌等呼吸道感染中發揮著重要作用［1－2］。有研究表明，NOD2缺陷的小鼠對胞內結核分枝桿菌的控制能力大大下降［3］，這提示NOD2可能在天然抗結核免疫中同樣起著至關重要的作用。然而，NOD2究竟通過何種機制來調控和影響抗結核免疫仍不清楚。筆者利用人肺泡巨噬細胞為研究對象，揭示了NOD2信號對其抗結核分枝桿菌活性的影響，并對產生這種影響的機制作了初步的探討。

1 材料與方法

1.1 巨噬細胞來源 巨噬細胞分離自15例志愿者的支氣管肺泡灌洗液，15例志愿者均來自廣東省人民醫院呼吸病中心，均為抗人類免疫缺陷病毒1、2型（HIV－1、2）陰性，胸片正常，無結核暴露史。

1.2 人肺泡巨噬細胞的分離和培養 參考有關文獻［4］，行支氣管肺泡灌洗術。收集灌洗液，2 000r／min離心后，棄上清，用RPMI1640培養液（含5%小牛血清）重懸細胞。

1.3 結核分枝桿菌的培養、感染與計數 將人肺泡巨噬細胞按每孔2×105接種于24孔板，按細胞比細菌5∶1的比例加入結核分枝桿菌H37Rv（ATCC 25618），37℃孵育1h，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌5次，洗去胞外的細菌，加入終濃度為10 μg／mL的鎂依賴性磷酸酶（MDP），InvivoGen公司，37℃分別培養0、24、48、72h后，加入0.1%Triton X100裂解細胞，將裂解液移入無菌環氧樹脂（EP）管中，10 000r／mim離心2min，去上清，用500μL Middlebrook 7H9培養液重懸，作10倍倍比稀釋后，涂 Middlebrook 7H11（含10%OADC）平板，37℃，保持濕度培養14～21d，計數菌落數。

1.4 胞內NOD2蛋白的流式檢測 離心收集人肺泡巨噬細胞，加入破膜緩沖液（Biolegend公司）、羊抗人NOD2和相應同型對照（Biolegend公司），4℃作用20min，洗滌細胞1次，加入異硫氰酸熒光素（FITC）標記的驢抗羊IgG（Santa Cruz公司），4℃避光作用20min，洗滌后用1%多聚甲醛固定后，于流式細胞儀上機檢測。

1.5 一氧化氮（NO）的檢測 將人肺泡巨噬細胞按每孔2×105鋪24孔板，在每孔中加入PBS或終濃度為10μg／mL的MDP和1μg／mL 脂 多 糖（LPS，InvivoGen公 司），37 ℃，5%CO2培養24h，收集上清，按試劑盒（碧云天公司）操作說明書檢測NO水平。

1.6 NOD2、一氧化氮合成酶（iNOS）與DEF4B基因表達的檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT－PCR）法，引物設計見表1。收集經過不同處理的人肺泡巨噬細胞，按照Catrimox－14TM RNA提取純化試劑盒（TaKaRa公司）的說明提取總RNA，取2μg RNA提取物按照RT－PCR試劑盒（TaKaRa公司）操作說明書進行 RT－PCR。RT－PCR反應：2μL 單鏈DNA模板、2×SYBR Premix EXTaq 10μL、0.05mmol／L dNTP、10μmol／L引物0.4μL、50×Rox reference dye、滅菌去離子水補足至20μL，95℃預變性10s，95℃5s、60℃30s，共40個循環。以GAPDH為內參照，采用2－△△CT相對定量法進行計算，PCR定量以相對于對照組的變化倍數形式表示。

1.7 活性氧類（ROS）檢測 將人肺泡巨噬細胞按每孔2×105鋪24孔板，用對ROS敏感的還原型二氯熒光素（DCFH）熒光探針（碧云天公司）標記細胞，在每孔中加入PBS或終濃度為10μg／mL的 MDP和1μg／mL LPS，用EnVision多標記分析系統在激發光485nm，發射光535nm測定細胞內產生的熒光量的變化，反映細胞內ROS的產生量。

1.8 統計學處理 各組實驗獨立重復3次，用SPSS13.0軟件分析結果，各樣本處理前后NO水平、iNOS與DEF4B相對表達量和DCFH－DA熒光強度均以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 各基因Realtime PCR引物的設計

2 結 果

2.1 NOD2在人肺泡巨噬細胞中的表達 流式細胞術結果顯示，人肺泡巨噬細胞胞漿中存在NOD2蛋白的表達，同時，PCR結果表明NOD2基因在該細胞中也有表達，見圖1。

圖1 NOD2在人肺泡巨噬細胞中的表達

圖2 NOD2信號對人肺泡巨噬細胞抗結核分枝桿菌活性的影響

2.2 NOD2信號對人肺泡巨噬細胞抗結核分枝桿菌活性的影響 MDP刺激后，人肺泡巨噬細胞對結核分枝桿菌H37Rv在胞內生長的控制能力明顯增強。從48h以后，加入MDP組和未加入MDP組開始出現差異，72h時未加入MDP組的胞內細菌數為MDP處理組的2.14倍，見圖2。

2.3 NOD2信號對人肺泡巨噬細胞NO分泌及iNOS表達的影響 MDP刺激后，人肺泡巨噬細胞NO的分泌和iNOS的表達均有不同程度的增強，見圖3，但較陽性對照LPS的作用弱。

圖3 NOD2信號對人肺泡巨噬細胞NO分泌及iNOS表達的影響

圖4 NOD2信號對人肺泡巨噬細胞ROS分泌的影響

2.4 NOD2信號對人肺泡巨噬細胞ROS分泌的影響 MDP刺激后，人肺泡巨噬細胞ROS的分泌變化并不明顯，見圖4。而作為陽性對照的LPS卻誘導了明顯的ROS產生。

2.5 NOD2信號對人肺泡巨噬細胞DEF4B表達的影響MDP刺激后，人肺泡巨噬細胞中抗菌肽DEF4B基因的表達明顯上調，見圖5。

圖5 NOD2信號對人肺泡巨噬細胞DEF4B表達的影響

3 討 論

NOD2是一種胞內模式識別受體，其與配體結合后，可以誘發一系列炎性因子的產生［5－7］，從而在抗感染免疫中發揮重要作用。近年來，關于NOD2對抗胞內菌感染的貢獻日益受到人們的關注，這其中就包括了結核分枝桿菌的感染［8］。有研究表明，NOD2缺陷的小鼠控制結核分枝桿菌的能力明顯減弱［3］，說明NOD2在天然抗結核免疫中具有重要作用。

巨噬細胞既是結核分枝桿菌寄生的場所，同時又是抗結核免疫的主要效應細胞。最近，人們發現NOD2可以在人肺泡巨噬細胞中表達［9］，但其在結核天然免疫中的作用及機制并不清楚。筆者利用流式細胞術和PCR的方法分別在蛋白和基因水平證實了NOD2在人肺泡細胞中的表達。在天然抗結核免疫中，巨噬細胞主要通過NO和ROS的分泌、自噬作用及抗菌肽的釋放來殺滅胞內結核分枝桿菌［10－11］。有研究證實，NOD2信號刺激能誘導自噬酶IRGM的高表達和抗菌肽LL37的分泌，從而增強巨噬細胞殺滅結核分枝桿菌的效應［12］。本研究結果也表明，NOD2信號刺激能增強人肺泡巨噬細胞對胞內結核分枝桿菌的控制。為了進一步闡明這種效應的作用機制，筆者評價了NOD2信號刺激對人肺泡巨噬細胞NO、ROS及另外一種重要的抗菌肽——DEF4B的分泌或表達的影響。研究結果顯示，MDP刺激后，人肺泡巨噬細胞中NO的分泌和DEF4B的表達水平明顯增加，這提示NOD2可能通過這兩者在抗結核天然免疫中發揮作用。令人意外的是，MDP刺激后，ROS水平變化并不明顯，這可能與NOD2信號激發的基因表達譜有關。

總而言之，本研究結果提示NOD2可能參與了早期的抗結核感染免疫，從而阻止疾病的進展。這種效應與其誘導的NO和抗菌肽DEF4B的產生有關，而與ROS關系并不明顯，其具體機制仍待進一步研究證實。

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