應用MLPA技術分析非平衡性染色體結構異常＊

謝潤桂，婁季武，劉彥慧，林洋洋

（東莞市婦幼保健院產前診斷中心，廣東東莞523107）

多重連接依賴探針擴增（MLPA）是一種結合分子雜交、連接和聚合酶鏈反應（PCR）的半定量檢測技術，于同一反應管內可同時檢出40個不同核苷酸序列拷貝數的變化［1］。和臨床常規應用的染色體核型分析技術相比，MLPA具有快速、特異、靈敏、高效的特點。MLPA在染色體病診斷方面主要用于快速檢測胎兒染色體非整倍體數目異常［2－4］，而在非平衡性染色體結構異常診斷中的應用比較少。本研究聯合利用染色體非整倍體檢測試劑盒及染色體亞端粒檢測試劑盒分析6例非平衡性染色體結構異常，旨在探討MLPA在非平衡性染色體結構異常診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 6例研究對象均為于本院接受產前診斷的孕婦，孕婦及其家屬均知情同意。病例1，孕18周，胎兒生長發育受限，母親血清學篩查示唐氏綜合征（簡稱唐氏）高風險；羊水核型檢查示：45，XX，der（13；18）（q10；q10）；父母核型均正常。病例2，孕27周，母親血清學篩查示唐氏高風險，B超提示胎兒單臍動脈；臍血核型檢查示：45，XX，del（18）（q22）；父母核型均正常。病例3，孕18周，母親血清學篩查示唐氏高風險；羊水核型檢查示：46，X，i（Xq）（q10）；父母核型均正常。病例4，孕18周，母親血清學篩查示唐氏高風險，B超提示胎兒單臍動脈；羊水核型檢查示：45，XY，dic（15；18）（p11.2；p11.2），18號染色體短臂末端疑似存在缺失；父母核型均正常。病例5，孕26周，B超提示胎兒雙側腦室擴張，長骨短；羊水核型檢查示：47，XY，＋Mar，Mar似9號染色體短臂；父母核型均正常。病例6，孕26周，B超提示胎兒多發畸形，胎頭呈草莓狀，小腦下蚓部及左眼球發育不良，室間隔缺損，胃十二指腸梗阻性病變，右足趾發育不良，左趾姿態異常；臍血核型檢查示：45，XY，－13，＋Mar；父母核型均正常。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 采集羊水或臍血及夫婦外周血標本，采用酚氯仿法提取基因組DNA，測定DNA濃度及純度。

1.2.2 MLPA檢測 采用荷蘭MRC－Holland公司P095染色體非整倍體檢測試劑盒及P036、P070亞端粒區檢測試劑盒。DNA變性，探針雜交、連接及擴增均參照試劑盒說明書。采用美國ABI公司3500XL遺傳分析儀對擴增產物進行毛細管電泳分析，生成的數據采用GeneMapper軟件（美國ABI公司）及Coffaylser9.4軟件（荷蘭MRC－Holland公司）進行分析。

2 結 果

6例病例胎兒MLPA檢測結果均存在異常，并且均涉及亞端粒區異常，見表1。各病例父母MLPA檢測均未見異常。病例1、2、3胎兒 MLPA檢測發現18p11.3、18p11.2、18q23探針信號減弱，與核型分析所發現的18號染色體存在或可疑存在部分缺失相符合。病例4胎兒X染色體長臂等臂［核型46，X，i（Xq）］MLPA檢測表現為X染色體短臂探針信號減弱，長臂信號增強。MLPA分析結果提示病例5、6胎兒的標記染色體分別來自于9號和13號染色體短臂片段。

表1 染色體異常標本核型及MLPA檢測結果

3 討 論

本研究聯合采用染色體非整倍體檢測試劑盒及染色體亞端粒檢測試劑盒分析了6例非平衡性染色體結構異常，均發現相應探針信號異常。病例1、2、3胎兒核型分析已經明確了缺失或重復的染色體片段來源，MLPA P095、P036／070試劑盒均檢出相應探針信號減弱或增強，可以驗證核型分析的結果。病例1、病例2胎兒核型分析均顯示18號染色體短臂18p11.3存在部分缺失，MLPA檢測結果也提示18p11.3探針信號減弱。病例3胎兒核型為46，X，i（Xq）（q10），MLPA檢測結果也表現出很典型的特點：X染色體短臂探針信號全部減弱，長臂探針信號全部增強；提示X染色體短臂存在部分單體，而長臂存在部分三體。

MPLA檢測也可幫助確定核型分析中可疑的染色體缺失或重復。如病例4所示，孕婦羊水染色體核型為45，XY，dic（15；18）（p11.2；p11.2），雙著絲粒染色體中18號染色體疑似存在短臂小片段缺失。MLPA檢測結果顯示18號染色體短臂（18p11.21）上1個探針信號減弱，提示18號染色體短臂末端18p11.21存在缺失。同樣，對于核型分析中出現的Mar片段，經MLPA檢測后也反映出染色體拷貝數變化的信息。這些信息對確定Mar片段的染色體來源具有指導意義。如病例5、6所示，病例5胎兒染色體核型為47，XY，＋Mar，Mar疑似為9號染色體短臂，MLPA P036／070檢測顯示9號染色體短臂亞端粒區探針信號增強，而父母9號染色體短臂亞端粒區信號正常，因此可以證實該Mar片段來源于9號染色體短臂。病例6胎兒染色體核型為45，XY，－13，＋Mar，B超提示胎兒多發畸形，畸形表現符合帕陶氏綜合征的表現，但核型不能確認Mar片段是否來自13號染色體。MLPA檢測提示13號染色體13q21.3－q34存在缺失，與核型分析結果一致，而13q12.3－q14.3探針信號增強，說明 Mar片段來源于13號染色體13q12.3－q14.3片段。

本研究中的6例非平衡性染色體結構異常病例均經亞端粒MLPA檢出染色體末端缺失或重復。涉及染色體末端的非平衡性染色體結構異常很常見［5－7］。亞端粒 MLPA含有針對23對染色體長臂和短臂末端的探針，能夠準確檢測染色體末端的微小缺失或重復［5］。MLPA P095染色體非整倍體檢測試劑盒含有21、18、13、X染色體8對探針，Y染色體4對探針，通常用于檢測21、18、13、X、Y染色體的非整倍體數目異常。本研究中5例涉及常見發生異常的13、18、X染色體，MLPA P095試劑盒也檢出相應位置探針信號的增強或重復，說明采用MLPA檢測染色體非整倍體改變時，如果發現個別探針，特別是染色體尾端的探針信號異常，需要加以注意。其他研究也報道了由于染色體結構異常而導致MLPA個別探針信號變化的情況［8］。

另一種常用于染色體平衡易位與非平衡易位檢測的技術是熒光原位雜交（FISH）［9］。與 MLPA相比，FISH檢測信號直觀、準確，并且能夠發現異常染色體在整套染色體中的定位。但FISH需要針對不同的平衡或非平衡易位設計（或購買）不同的探針，增加了實驗的復雜性。此外，受限于熒光標記種類，FISH很難一次檢測全部染色體。而MLPA一次實驗可同時檢測多個標本，并且亞端粒MLPA可以對每個標本的23對染色體長、短臂末端進行掃描，不需要針對不同染色體的不平衡易位設計不同探針，大大提高了檢測的方便性和經濟性。但是，由于受探針密度的限制，MLPA很難確定染色體缺失或重復的范圍，且MLPA分析的是探針信號的強弱，只能判斷有無缺失或重復，而不能發現異常染色體在整套染色體中的定位。因此，兩者具有相互性［10］。

綜上所述，MLPA技術，特別是亞端粒MLPA技術在非平衡性染色體結構異常診斷中具有重要價值，可以做為細胞遺傳學診斷的輔助方法。

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［2］van Opstal D，Boter M，de Jong D，et al.Rapid aneuploidy detection with multiplex ligation－dependent probe amplification：aprospective study of 4000amniotic fluid samples［J］.Eur J Hum Genet，2009，17（1）：112－121.

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［10］ Bruno DL，Burgess T，Ren H，et al.High－throughput analysis of chromosome abnormality in spontaneous miscarriage using an MLPA subtelomere assay with an ancillary FISH test for polyploidy［J］.Am J Med Genet A，2006，140（24）：2786－2793.