免疫印跡法測(cè)定Tp47蛋白與梅毒患者血清的免疫反應(yīng)性＊

鄭和平，覃曉琳，黃進(jìn)梅，薛耀華，白 順，呂 萍，楊 斌

（廣東省皮膚性病防治中心，廣東廣州510091）

梅毒是由梅毒螺旋體（Tp）感染引起的性傳播疾病，病程漫長(zhǎng)，早期侵犯生殖器和皮膚，晚期侵犯全身各器官，幾乎能累及全身各個(gè)臟器，危害極大［1］。Tp潛伏感染時(shí)間長(zhǎng)，可很長(zhǎng)時(shí)間無(wú)明顯臨床癥狀。因此，早期診斷對(duì)控制梅毒的傳播具有重要意義。目前，診斷Tp感染主要通過(guò)血清學(xué)方法檢測(cè)Tp非特異性抗體和特異性抗體。這些試驗(yàn)均采用Tp天然抗原作為診斷抗原，而Tp目前還不能在體外持續(xù)培養(yǎng)，從而導(dǎo)致制備天然抗原較困難。因此，多采用基因重組方法制備Tp抗原代替天然抗原以建立酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）或免疫印跡法（Western－Blot）檢測(cè)血清中的抗Tp抗體［2］。目前已重組的Tp抗原有20多種，其中Tp47是Tp外膜脂蛋白［3］，重組Tp47不僅具有高免疫原性，而且能夠作為T(mén)p診斷抗原，在梅毒診斷中具有重要意義［4］。本研究利用分子克隆技術(shù)獲得Tp47重組蛋白，并通過(guò)Western－Blot對(duì)其免疫反應(yīng)性進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 一般資料 Tp Nichols標(biāo)準(zhǔn)株、載體pGEX－6P－1由本院保存，表達(dá)宿主菌大腸埃希菌（E.coli）BL21（DE3）購(gòu)自廣州科昂公司。18例不同臨床分期梅毒患者陽(yáng)性血清標(biāo)本、10例梅毒陰性血清標(biāo)本為本院臨床檢測(cè)標(biāo)本。

1.2 試劑 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自亞能公司；DNA分子標(biāo)記物、Taq DNA聚合酶、T4連接酶、限制性內(nèi)切酶、GST純化柱均購(gòu)自大連Takara公司；蛋白分子標(biāo)記物購(gòu)自Fermentas公司；質(zhì)粒提取試劑盒、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增產(chǎn)物快速膠回收試劑盒和DNA純化試劑盒購(gòu)自碧云天公司；異丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG）、氨芐西林購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)有限公司，三羥甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、丙烯酰胺、LB培養(yǎng)基購(gòu)自Sigma公司。PCR產(chǎn)物合成及DNA測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)有限公司完成。

1.3 方法

1.3.1 Tp47重組質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)GenBank中的Tp47基因序列（M88769.1），去除信號(hào)肽序列，設(shè)計(jì)引物，委托上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。使用基因組DNA提取試劑盒提取Tp Nichols株基因組DNA，操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以提取的DNA為模板，PCR擴(kuò)增Tp47基因。反應(yīng)體系如下：模板2μL，引物0.1μmol／L，dNTP 200μmol／L，MgCl22mmol／L，Ex Taq酶2U；反應(yīng)條件：94 ℃ 10min，94℃45s、58℃45s、72℃1min循環(huán)40次，72℃10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)PCR產(chǎn)物快速膠回收試劑盒純化回收，將純化后的PCR產(chǎn)物和pGEX－6P－1質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，將純化后的酶切PCR產(chǎn)物插入到質(zhì)粒pGEX－6P－1中，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX－6P1－Tp47，通過(guò)測(cè)序鑒定獲得陽(yáng)性克隆。

1.3.2 重組蛋白的表達(dá)及純化 將構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒pGEX－6P1－Tp47轉(zhuǎn)化至宿主菌 E.coli BL21（DE3），挑取單個(gè)陽(yáng)性克隆至含有氨芐西林的LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜，次日按照1∶20的比例接種至新的含氨芐西林的培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)2～3h，菌液600nm光密度值為0.6～1.0時(shí)加入1mmol／L IPTG，37℃誘導(dǎo)表達(dá)4～6h，同時(shí)設(shè)未誘導(dǎo)組。離心收集菌體，用磷酸鹽緩沖液重懸后，在冰浴中超聲破碎細(xì)菌，離心，取上清用GST標(biāo)簽蛋白純化樹(shù)脂進(jìn)行純化，具體操作參照純化說(shuō)明書(shū)。表達(dá)及純化產(chǎn)物進(jìn)行SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）和 Western－Blot鑒定。

1.3.3 Tp47重組蛋白的鑒定 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后收集細(xì)菌加入SDS－PAGE上樣緩沖液，煮沸3min，冷卻后離心，取上清10 μL進(jìn)行12%SDS－PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色后拍照記錄結(jié)果。將誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后和純化的重組蛋白分別上樣，進(jìn)行SDSPAGE電泳后，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，先用5%脫脂牛奶室溫封閉2h，然后加入一抗（GST標(biāo)簽單克隆抗體，1∶2 000）室溫孵育2h，用TBST洗滌3次，每次5min，再加入二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，1∶3 000）室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，每次5min，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯影，TANTEN成像儀拍照記錄結(jié)果。

1.3.4 Western－Blot分析重組蛋白的免疫反應(yīng)性 將純化的重組蛋白上樣進(jìn)行SDS－PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，制備成含重組蛋白的膜條，以18例不同期梅毒患者血清作為一抗（1∶1 000），以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG（1∶3 000）作為二抗，進(jìn)行Western－Blot檢測(cè)，ECL顯影，TANTEN成像儀拍照記錄結(jié)果。隨后，將該膜條經(jīng)0.2mol／L NaOH作用30min，以10例臨床梅毒陰性患者血清作為一抗（1∶1 000），以羊抗人IgG（1∶2 000）作為二抗，進(jìn)行 Western－Blot檢 測(cè)，ECL 顯影，TANTEN成像儀拍照記錄結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 Tp47重組質(zhì)粒的構(gòu)建 經(jīng)PCR從Tp標(biāo)準(zhǔn)株DNA中擴(kuò)增得到Tp47基因片段，酶切，切膠回收PCR產(chǎn)物，將回收產(chǎn)物連接到載體pGEX－6P－1中，經(jīng)測(cè)序鑒定證實(shí)插入片段為T(mén)p47基因片段，測(cè)序結(jié)果與GenBank收錄的序列完全一致。

2.2 Tp47重組蛋白表達(dá)、純化及鑒定 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3），挑取陽(yáng)性重組菌進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)12%SDS－PAGE分析，可見(jiàn)相對(duì)分子質(zhì)量約為71×103的目的蛋白條帶，大小與理論值相符（見(jiàn)圖1）。將誘導(dǎo)后的蛋白進(jìn)行 Western－Blot鑒定，ECL顯影后得到 Western－Blot結(jié)果（見(jiàn)圖2），在約71×103處有一明顯蛋白帶，未誘導(dǎo)的樣品為陰性。

2.3 Tp47重組蛋白的免疫反應(yīng)性 將純化的重組蛋白經(jīng)SDS－PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，切成多份小膜條，分別用6例一期、6例二期和6例三期梅毒患者血清和10例梅毒陰性患者血清作為一抗，以羊抗人IgG作為二抗進(jìn)行免疫印跡分析，結(jié)果顯示Tp47重組蛋白可與一期至三期梅毒患者血清發(fā)生反應(yīng)，而與梅毒陰性患者血清無(wú)反應(yīng)，見(jiàn)圖3～4。

圖1 SDS－PAGE分析TP47蛋白的表達(dá)及純化

圖2 Western－Blot分析TP47重組蛋白的表達(dá)及純化

圖3 Western－Blot分析Tp47重組蛋白的免疫反應(yīng)性

圖4 Western－Blot分析Tp47重組蛋白的特異性

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)有多種Tp外膜脂蛋白具有很強(qiáng)的反應(yīng)原性，其中TP15、TP17、TP0453、TP47已聯(lián)合應(yīng)用于ELISA梅毒檢測(cè)試劑盒，其中TP47蛋白被認(rèn)為是Tp內(nèi)豐度最高、抗原性強(qiáng)和特異性好的抗原［5］。Lemos等［6］報(bào)道，在梅毒初期 Tp47蛋白的抗原反應(yīng)性較其他抗原更敏感，說(shuō)明該蛋白為主要免疫原，可作為梅毒的早期診斷指標(biāo)。Sato等［7］也報(bào)道，Tp47抗原表位不僅可檢測(cè)一期梅毒，也是活動(dòng)性梅毒的一個(gè)標(biāo)志，對(duì)于伴有人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV）感染的梅毒患者，在Tp抗體滴度低于一般梅毒患者情況下，也可檢測(cè)Tp47抗體。因此Tp47蛋白是梅毒診斷中的重要抗原。

本研究采用基因重組技術(shù)克隆了Tp47基因，成功構(gòu)建了Tp47重組質(zhì)粒，并獲得了高濃度表達(dá)的以包涵體形式存在的Tp47重組蛋白。進(jìn)一步采用Western－Blot分析純化重組蛋白的免疫反應(yīng)性，顯示其能與臨床各期梅毒陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng)，而與梅毒陰性血清無(wú)交叉反應(yīng)，說(shuō)明Tp47重組蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性，同時(shí)敏感性較高，血清用量比商品化 Western－Blot檢測(cè)試劑盒用量（1∶200）小5倍。

有研究通過(guò) Western－Blot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Tp47在一期梅毒、二期梅毒、潛伏梅毒和血清固定梅毒中陽(yáng)性率分別為87.5%、100.0%、93.3%和92.3%［8］。本研究選擇的梅毒陽(yáng)性血清包括一期、二期和三期梅毒血清，由于各血清標(biāo)本梅毒螺旋體明膠凝集試驗(yàn)（TPPA）均為陽(yáng)性（TPPA滴度不小于1：80），甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)（TRUST）為陽(yáng)性（TRUST滴度不小于1：1），結(jié)果顯示Tp47均呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，且敏感性未存在明顯差異。

本研究中，Tp47蛋白純化過(guò)程中洗脫的第一管濃度較大，在目的蛋白大小附近含有微量菌體雜蛋白，在免疫反應(yīng)性檢測(cè)時(shí)選用了濃度較高的第一管，因此結(jié)果中部分膜條顯示有少量雜帶現(xiàn)象。本研究表達(dá)Tp47重組蛋白表達(dá)量高，雖然含有GST標(biāo)簽，同時(shí)存在于包涵體中，但是仍然具有較好的免疫反應(yīng)性，為下一步研究該蛋白在梅毒早期或合并HIV感染的診斷中奠定了良好基礎(chǔ)。

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