基因芯片技術在雞病毒性疾病診斷中的應用

楊國淋，文心田，曹三杰，黃小波，馬　銳，常曉霞，張　仙（四川農業大學動物醫學院動物傳染病與基因芯片實驗室，四川成都611130）

基因芯片技術在雞病毒性疾病診斷中的應用

楊國淋，文心田，曹三杰，黃小波，馬銳，常曉霞，張仙
（四川農業大學動物醫學院動物傳染病與基因芯片實驗室，四川成都611130）

禽流感、新城疫均為一類傳染病，傳染性強，發病率高；雞傳染性囊病、雞傳染性支氣管炎等也是影響我國家禽養殖業健康發展最為常見的疾病。目前世界各國都十分重視對這些疾病的防治，努力研究一種準確、快速、特異性高的方法進行疾病的診斷。

基因芯片技術是隨著人類基因組計劃的研究應運而生，又稱DNA微陣列。1986年由Dulbecco首次提出[1]，將高密度的DNA片段通過高速機械手或原位合成方式以一定的排列方式使其附著在固相表面與熒光標記的DNA探針雜交，通過對雜交信號的檢測分析，即可檢測出樣品的遺傳信息。該技術具有快速、平行、高通量等優點。通過近幾十年的發展，基因芯片技術在生命科學研究中被廣泛地用于基因表達分析、病原體的檢測、藥物篩選和疾病的診斷等領域[2-4]。

1　基因芯片技術的基本環節

1.1芯片的設計與制備基因芯片核酸探針序列的設計取決于研究的目的，一般從已知基因的cDNA或EST庫中選擇特異性高的探針序列，保證與待測目的基因的特異結合。基因芯片的制備是通過原位合成或點樣法將已知的探針序列固定在已修飾好的介質上。介質支持物可以是玻璃、生物膜、塑料等，玻片是目前最常用的支持物。芯片制備之前要對載體進行修飾，使其表面有可進行化學反應的活性基團，有良好的穩定性和生物兼容性，以便與生物分子進行偶聯。芯片制備方法主要包括2類：（1）原位合成法：該方法于1991年由Fodor S.等[5]建立，美國Affymetrix公司率先開展了這方面的研究，該方法適用于大規模制備芯片，可以實現高密度芯片的標準化和規模化生產；（2）點樣法：經機械手對合成好的探針點樣制備芯片，該方法可以自己設計樣點的排列方式。

1.2靶基因的制備與標記靶基因的制備與標記是基因芯片流程的一個重要環節。由于靶基因不能與芯片探針直接雜交，待分析基因在雜交之前需以DNA、RNA為模板進行擴增核酸，然后用同位素或熒光素標記，目前一般用熒光素Cy3 或Cy5進行標記[6]。近年來新發展的納米金標記制備可視化基因芯片，放大信號后可直接用肉眼觀察結果，具有很好的靈敏度和特異性，在臨床應用上具有重要價值[7]；由于雜交過程中是單鏈反應，在雜交過程中雙鏈會發生競爭反應，影響雜交效率，目前主要應用不對稱PCR技術來制備單鏈產物，提高芯片的雜交效率[8]。

1.3芯片雜交反應芯片的雜交反應是芯片檢測中最關鍵的一步。由于該反應是固液雜交。所以要根據探針的長度、GC含量及芯片的類型來優化雜交條件。通常情況下，影響異源雜交雙鏈形成的因素包括樣品核酸的濃度、探針的濃度、雜交時間和溫度等多方面的條件。雜交過程要通過不斷地優化反應條件，使雜交的假陽性和假陰性降到最低，從而獲得最能反映生物本質的信號，確保實驗結果的可靠性和真實性。

1.4芯片雜交信號的檢測與分析熒光標記的樣品核酸與芯片探針雜交后，用熒光共聚焦掃描儀掃描，采集各雜交點的熒光信號位置、熒光強弱，然后經計算機軟件進行分析，將圖像數字化，即可獲得有關的生物信息。由于基因芯片獲取的信息量大，對基因芯片雜交數據的分析、處理、查詢、比較等需要一個標準的數據格式。目前，大型基因芯片數據庫正在構建，目標是將每個芯片實驗室獲得結果集中起來，對數據進行評估和交流。

2　基因芯片在雞病檢測方面的主要應用

目前，我國雞病毒性傳染病流行的主要特點是多病原混合感染，非典型性疫病較多，給我國養雞業造成巨大的經濟損失。對于雞病毒性傳染病的診斷多采用傳統的病原分離及常規的血清學方法進行，但病原分離費時費力，而且敏感性和特異性都較差；血清學診斷方法也因實驗室條件和診斷方法的不同而產生一定的差異。雖然PCR診斷方法已廣泛應用于雞病毒性疾病的檢測，但只能對單一病原進行診斷，對于混合感染的病毒病檢測比較麻煩。而近年來發展起來的基因芯片技術具有高通量和并行化的特點，可以對成百上千甚至上萬個基因進行同時、快速、準確的檢測，從而很好地解決了這一問題[9-11]。目前，基因芯片技術在雞病毒性疾病中的應用主要有以下幾個方面。

2.1基因表達譜分析基因表達譜在芯片方面的研究十分廣泛，也是芯片研究最成熟的領域。可對比在不同條件下基因組中大量轉錄水平的差異，也可對比不同基因組中轉錄差異的表達，由于在芯片上可以固定成千上萬的探針，這使得眾多基因可以同時進行檢測。從根本上突破了以前基因研究中只能關注一個或幾個基因的瓶頸，極大地推動了相關研究的進展。朱靜等[12]在基因芯片技術的原理上用數字基因表達譜和熒光定量PCR篩選導致雞喙畸形相關的差異基因。對200個雞喙選擇差異表達基因進行數字基因表達譜測序和熒光定量驗證，兩種技術的檢測結果一致。宦海霞等[13]應用DNA芯片研究雞致病性大腸桿菌可能致病基因的表達。構建雞致病性大腸桿菌毒力基因、潛在毒力基因的DNA芯片，成功篩選了雞致病性大腸桿菌在體外不同條件下的毒力基因及可能毒力基因中差異表達基因。

2.2病毒的基因分型檢測基因芯片同其他分子生物學檢測技術相比，最大的優勢在于其高通量的特點。大多數的病毒易產生變異，特別是當變異產生一定的臨床意義的時候，針對變異區進行序列分析就十分具有意義。基因芯片技術具有高靈敏性、高通量、快速檢測等特點，為病毒基因分型提供了依據。楊忠蘋等[14]用克隆禽流感病毒的M基因，H5、H7、H9亞型HA基因，N1、N2亞型NA基因以及看家基因GAPDH的重組質粒為模板，用PCR方法擴增制備探針，純化后點于氨基修飾的玻片，制備基因芯片。對臨床樣品進行檢測，結果研究表明，該芯片可用于同步鑒別流行的禽流感亞型，是一種有效的新方法；王秀榮等[15]構建了檢測H5、H7、H9亞型禽流感病毒的基因芯片，在病毒RNA反轉錄過程中，用Cy5標記樣品cDNA，掃描芯片上探針結合位點，雜交信號與預期設想基本一致，能夠快速診斷禽流感的各種亞型；Li J.等[16]建立了用以鑒別流感病毒型和亞型的基因芯片檢測方法，設計的26個引物對可從A型流感病毒HA（H1、H2、H3）、NA（N1、N2）和NP基因以及B型流感病毒的HA（H1、H2、H3）、NA（N1、N2）和NP基因上的目的基因雜交，從而達到鑒別型和亞型的目的。

2.3疾病診斷基因芯片用于疾病診斷有高度的靈敏性、準確性、快速、同時檢測多種疾病等優點。陶啟蒙等[17]應用不對稱RT-PCR和基因芯片兩種技術，構建了可同時區分AIV的H5、H7、H9血凝素亞型和NI、N2神經氨酸酶亞型以及雞傳染性支氣管炎病、新城疫、雞傳染性囊病的基因芯片。樣品檢測結果與RT-PCR、雞胚接種有較高一致性，符合率分別為100%和96%，具有很好的特異性、敏感性。石霖等[18]將蛋白質芯片技術、免疫膠體金技術和銀顯影技術進行有機的結合，建立并優化了可同時鑒別診斷AI、ND、IB、IBD等4種雞病血清抗體的可視化蛋白質芯片技術平臺。利用該方法檢測18份臨床樣品，結果分析可視化蛋白芯片具有很好的特異性，是一種有效的抗體檢測新方法；Tao Q.等[19]應用寡核苷酸基因芯片技術和不對稱RT-PCR技術制備出能同時區分AIV的H5、H7、H9血凝素亞型和NI、N2神經氨酸酶亞型以及雞傳染性支氣管炎病、新城疫、雞傳染性囊病的基因芯片。他們還對制備的芯片進行了敏感性、特異性和保存期驗證，得到了與預期一致效果，表明該技術能應用于實際生產；張偉等[20]以纖維素膜作為生物制作的基質，通過微量點樣制備基因芯片，檢測新城疫病毒、低致病性禽流感病毒、傳染性支氣管炎病毒、減蛋綜合征病毒、傳染性喉氣管炎病毒、雞毒支原體。芯片的靈敏度為RT-PCR和病毒分離的102和104倍，動物實驗結果符合率在95%以上；吳時友等[21]應用PCR和RT-PCR方法獲得雞新城疫、禽流感、雞傳染性支氣管炎、雞傳染性囊病、雞傳染性喉氣管炎、雞馬立克病、減蛋綜合征、禽網狀內皮組織增生癥、雞腦脊髓炎、雞傳染性貧血、雞病毒性關節炎、包涵體肝炎、禽白血病、雞痘的特異性片段，以這些片段為探針，采用接觸式點樣技術制成低密度的陣列芯片，用該芯片可同時檢測出14種雞類傳染病。

3　基因芯片在設計中應注意的問題

3.1探針引物設計基因芯片在制備前首先要按照探針設計原則[22]，設計特異性高的探針，對于原核生物設計cDNA芯片比較合適，因為原核微生物的RNA不帶PolyA的尾巴，難以和rRNA區分開，因此對mRNA進行特異性的標記比較困難，而且原核微生物基因組DNA上所含內含子少，易于以基因組DNA序列為模板設計PCR引物。而對于真核生物，對已知基因序列設計長寡核苷酸探針的芯片比較合適，因為真核生物的基因組比較復雜，基因家族間的同源性較高，寡核苷酸針具有更好的特異性；真核生物的mRNA含有PolyA的尾巴，容易對mRNA進行特異性的標記。

3.2PCR產物純化的方式在制備cDNA芯片時，首先需要通過PCR擴增靶基因，PCR產物的純化對結果影響較大，相關研究表明[23]PCR產物不需要過柱純化，因為過柱純化由于洗脫液中鹽的成分不確定，可能導致PCR產物難以在芯片上進行固定，導致DNA點樣的樣點形狀不好。用異丙醇或乙醇沉淀回收的PCR產物足以滿足制備芯片的需求。

3.3芯片點樣時樣品溶解所用點樣液的選擇

芯片一次取樣往往不超過0.3 μL，而需要持續點多個點，因此在點樣過程中，需要防止點樣針里的樣品揮發而導致點樣失敗。所以選擇芯片點樣緩沖液應含有核酸穩定劑、防水分揮發劑和黏度增稠劑等成分，能夠增加核酸在芯片上的固定效率，提高DNA芯片上點雜交信號的強度和均勻性。

3.4不同探針所用基片的選擇長度20～40 bp的寡核苷酸探針，一般用來制備檢測微生物和miRNA的芯片，對于合成的寡核苷酸探針末端一般要進行氨基修飾，可用來檢測單個堿基的不同，提高檢測的特異性，寡核苷酸探針需要點制在醛基玻片上。長度在60～70 bp的寡核苷酸探針或PCR產物，一般用來診斷疾病或檢測基因的表達，點制這樣的探針一般使用氨基修飾的基片[24]。

4　存在問題及展望

目前，基因芯片技術在雞病毒性疾病診斷中的應用主要存在以下幾個方面的問題需要解決[25-27]：首先芯片的制備以及雜交的過程中都無法脫離PCR技術的限制；其次在疾病診斷方面基因芯片技術還不能實現準確的定量分析；其中最大的問題還是芯片儀器價格昂貴，限制了它的廣泛使用。但是相信隨著生物科學、信息學等學科的發展，基因技術將不斷成熟，降低成本，形成產業化、自動化。在生命科學、醫學和其他領域中扮演重要的角色。

參考文獻：

[1] Dulbecco R . A turning point in cancer research：sequencing the human genome[J].Science，1986，231：1055-1056.

[2]步恒富，祝慶余.基因芯片技術在致病微生物研究中的應用[J].國外醫學:微生物學分冊，2001，24（1）：8-11.

[3] Sanders M A，Valk P J M.Genome-Wide Gene Expression Profil?ing，Genotyping，and Copy Number Analyses of Acute Myeloid Leukemia Using Affymetrix Gene Chips[J] . Pharmacogenomics，2013，155-177.

[4] Wang X，Shi L，Tao Q，et al.A protein chip designed to differen?tiate visually antibodies in chickens which were infected by four different viruses[J] . Journal of virological methods，2010，167 （2）：119-124.

[5] Fodor S，Rava R P，Huang X C，et al . Multiplexed biochemical assays with biological chips[J].Nature，1993，364：555-556.

[6] Dudda Subramanya R，Lucchese G，Kanduc D，et al.Clinical ap?plications of DNA microarray analysis[J] .Journal of Experimental Therapeutics and Oncology，2003，3（6）：297-304.

[7] Park S J，Taton T A，Mirkin C A . Array-based electrical detec?tion of DNA with nanoparticle probes[J] . Science，2002，295 （5559）：1503-1506.

[8]張海燕，馬文麗，李凌，等.應用不對稱PCR技術提高寡核苷酸基因芯片雜交效率[J].軍醫進修學院學報，2005，26（4）：266-268.

[9] Roh S W，Abell G C J，Kim K H，et al . Comparing microarrays and next-generation sequencing technologies for microbial ecolo?gy research[J].Trends in biotechnology，2010，28（6）：291-299.

[10]曹三杰，文心田，肖馳，等.幾種主要禽疫病診斷基因芯片的制備及初步應用[J].畜牧獸醫學報，2006，37（4）：356-360.

[11] Vernet G.DNA-chip technology and infectious diseases[J] .Virus research，2001，82（1）：65-71.

[12]朱靜.雞喙組織致畸基因的篩選與驗證[D].北京:中國農業科學院，2012.

[13]宦海霞，周瓊，趙李祥，等.應用DNA芯片技術研究體外表達禽致病性大腸桿菌可能致病基因[J].微生物學報，2008，48 （1）：103-111.

[14]楊忠蘋，王秀榮，田麗娜，等.利用基因芯片技術區分禽流感病毒主要亞型[J].微生物學報，2008，48（7）：935-940.

[15]王秀榮，鄧國華，于康震，等.在DNA芯片平臺上探測AIV不同亞型cDNA[J].中國農業科學，2005，38（2）：394-398.

[16] Li J，Chen S，Evans D H . Typing and subtyping influenza virus using DNA microarrays and multiplex reverse transcriptase PCR[J].Journal of clinical microbiology，2001，39（2）：696-704.

[17]陶啟蒙，王秀榮，武嘉男，等.不對稱RT-PCR結合芯片技術鑒別4種禽病的初步研究[J].中國預防獸醫學報，2008，30 （12）：954-958.

[18]石霖，王秀榮，楊忠蘋，等.4種禽病毒抗體可視化蛋白芯片的制備及應用[J].中國農業科學，2009，42（4）：1413-1420.

[19] Tao Q，Wang X，Bao H，et al . Detection and differentiation of four poultry diseases using asymmetric reverse transcription poly?merase chain reaction in combination with oligonucleotide micro?arrays[J].Journal of Veterinary Diagnostic Investigation，2009，21 （5）：623-632.

[20]張偉，田振宇，鄭彤彤.六種禽病原檢測的基因診斷芯片的研制及臨床應用[J].中國農業科技導報，2009，11（5）：108-113. [21]吳時友，尹燕博，鄭彤彤，等.雞14種病毒病基因芯片的研究[J].中國動物檢疫，2005，22（7）：27-29.

[22]張新宇，高燕寧.PCR引物設計及軟件使用技巧[J].生物信息學，2004，2（4）：15-18.

[23]曹三杰.雞新城疫、雞傳染性支氣管炎基因芯片的構建及其檢測技術研究[D].雅安：四川農業大學，2004.

[24] Sekigawa I，Fujishiro M，Yamaguchi A，et al . A new hypothesis of the possible mechanisms of gender differences in systemic lu?pus erythematosus[J] . Clinical and experimental rheumatology，2010，28（3）：419-423.

[25]劉弘，張潤瑞，譚時銳，等.利用衍生DNA研制定量檢測基因芯片[J].云南大學學報：自然科學版，2012，34（005）：596-603.

[26] Quan J，Saaem I，Tang N，et al.Parallel on-chip gene synthesis and application to optimization of protein expression[J] . Nature biotechnology，2011，29（5）：449-452.

[27]邱秀文，吳小芹,黃麟，等.基因芯片技術在生物研究中的應用進展[J].江蘇農業科學，2014，42（5）：60-62.

通訊作者：文心田，E-mail：xintian3211@126.com

作者簡介：楊國淋（1989-），男，碩士生，主要從事動物傳染病的研究工作，E-mail：yangguolin1989@163.com

基金項目：公益性行業（農業）科研專項項目—動物多病原高通量排查與診斷技術應用研究（201203056）

收稿日期：2014-09-16

中圖分類號：Q789

文獻標志碼：A

文章編號：0529- 6005（2015）10- 0057- 03