尿足細胞標志蛋白podocalyxin在腎病綜合征合并急性腎損傷診斷中的價值

王福珍，丘昭文，朱杰，吳森超，林沖云，王朝暉

（1.福建醫(yī)科大學附屬龍巖市第一醫(yī)院腎內科，福建 龍巖 364000；2.上海師范大學數理學院，上海 200234；3.上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院腎內科，上海 200025）

·臨床論著·

尿足細胞標志蛋白podocalyxin在腎病綜合征合并急性腎損傷診斷中的價值

王福珍1，丘昭文1，朱杰2，吳森超1，林沖云1，王朝暉3

（1.福建醫(yī)科大學附屬龍巖市第一醫(yī)院腎內科，福建 龍巖 364000；2.上海師范大學數理學院，上海 200234；3.上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院腎內科，上海 200025）

目的探討原發(fā)性腎病綜合征（PNS）患者尿液中podocalyxin（PCX）的變化對急性腎損傷（AKI）的診斷價值。方法對PNS合AKI患者（n=33例，AKI組）和未合并AKI患者（n=24例，非AKI組）尿液PCX、血清半胱氨酸蛋白酶抑制物C（Cystatin C，Cys C）、血清低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和血漿清蛋白（ALB）水平進行檢測，觀察上述指標與病情關系。結果AKI組尿PCX（42.04±11.01）ng/ml顯著高于非AKI組（30.88±9.93）ng/ml；血清Cys C水平（1.91±0.54）mg/L顯著高于非AKI組（1.29±0.34）mg/L，而血清LDL-C和血漿ALB水平在兩組中比較差異無統計學意義。隨著AKI病情加重，估算的腎小球濾過率（eGFR）的減少，尿PCX、血清Cys C增加更為明顯。結論聯合檢測原發(fā)性腎病綜合征患者尿PCX、血清Cys C有助于AKI的診斷及病情判斷。

尿液；podocalyxin；腎病綜合征；急性腎損傷

原發(fā)腎病綜合征（primary nephrotic syndrome，PNS）常合并急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）。AKI會加重患者病情，增加治療難度和病死率。它可發(fā)生于PNS病程中的任何階段。若能及時診斷，合理治療，大部分患者腎功能可好轉，預后較好，但也有少數病例發(fā)展為慢性腎衰竭，需要終生替代治療。因此，探索PNS合并AKI的早期診斷生物學標志物是臨床研究的重要問題。PNS常常伴有足細胞的病變，因此，我們試圖通過檢測PNS患者尿液中足細胞標志蛋白之一podocalyxin的水平來分析其與PNS合并AKI之間的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料

選擇2011年1月-2013年3月福建醫(yī)科大學附屬龍巖市第一醫(yī)院腎內科住院的PNS患者。其中，男32例，女25例；年齡20～65歲，平均（30.5± 8.5）歲。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準，參加者均簽署知情同意書。自PNS發(fā)病（或復發(fā)）至入院時間為3～30 d，其中，33例合并急性腎損傷，24例腎功能正常作為對照組。所有病例均符合以下標準：①24 h尿蛋白定量＞3.5 g/d，血漿白蛋白＜30 g/L，伴或不伴水腫，高脂血癥；②排除繼發(fā)性腎病綜合征（如狼瘡性腎炎、乙型肝炎病毒相關性腎炎、過敏性紫癜性腎炎、腎淀粉樣變和糖尿病腎病等繼發(fā)性腎臟病變）；③所有病例均進行了腎活組織病理檢查。

1.2AKI的診斷

按2012年KDIGO指南的診斷和分期標準，即48 h內血肌酐上升≥0.3 mg/L或較原先水平增高50%；和（或）尿量＜0.5 ml/（kg·h）持續(xù)6 h以上（排除梗阻性腎病或脫水狀態(tài)）；并分為1～3期。1期為清肌酐升高達基礎值的1.5～1.9倍，或升高值≥26.5μmol/L（0.3 mg/dl），和（或）尿量＜0.5 ml/（kg·h）持續(xù)6～12 h；2期為血清肌酐升高達基礎值的2.0～2.9倍，和（或）尿量＜0.5 ml/（kg·h）持續(xù)12 h以上；3期為血清肌酐升高達基礎值的3.0倍，或血肌酐升高至≥353.6 umol/L，開始腎臟替代治療，和（或）尿量＜0.3 ml/（kg·h）持續(xù)24 h以上，或者無尿持續(xù)12 h及以上。

1.3研究方法

1.3.1分組方法每個研究對象入院時立即留取1次血液及尿液標本，入院時合并AKI患者以入院時腎功能所處分期列入相應分組，住院期間腎功能正常者列為對照組（非AKI組），住院期間出現急性腎損傷者列入腎損傷組（AKI組）。

1.3.2標本采集所有受試者取空腹靜脈血10 ml，采用西門子全自動生化分析儀測定血清肌酐、血清Cys C、血清總膽固醇、血清低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和血漿清蛋白（ALB）。留取24 h尿，記錄尿量后從中取出10 ml尿標本，尿蛋白定量采用鄰苯三酚紅比色測定法。

1.3.3尿podocalyxin的檢測采用CUSABIO有限公司生產的酶聯免疫試劑盒檢測尿PCX。具體操作步驟如下：留取腎病患者清潔中段晨尿10 ml，用無菌管收集尿液于2～8℃1 000×g離心15 min取上清用于實驗。分別設標準品孔、待測樣本孔。每孔分別加標準品或待測樣本100μl，輕輕晃動混勻，覆上板貼，37℃溫育2 h。棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標記抗體工作液100μl，覆上新的板貼，37℃溫育1 h。棄去孔內液體，甩干，洗板3次。每次浸泡2 min，200μl/每孔，甩干。每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液100μl，覆上新的板貼，37℃溫育1 h。棄去孔內液體，甩干，洗板5次。每次浸泡2 min，200μl/每孔，甩干。依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色15～30 min。依序每孔加終止溶液50μl，終止反應。在反應終止后5 min內用酶標儀在450 nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。

數據處理將標準品及樣本值減去SO孔數值后繪制曲線，以標準品的濃度為縱坐標（對數坐標），OD值為橫坐標（對數坐標），在對數坐標紙上繪出標準曲線。根據樣本OD值，由標準曲線查出相應的濃度。

1.3.4eGFR的計算采用針對中國慢性腎臟病患者改良的簡化MDRD公式來評算腎小球濾過率[1]，即eGFR（ml/min/1.73 m2）=175×[Scr（mg/dl）]-1.234×年齡-0.179×（女性×0.79）

1.4統計學方法

2 結果

2.1腎病綜合征合并與不合并急性腎損傷患者的各項臨床指標比較

與非AKI組相比較，AKI組患者尿PCX、血Cys C、血肌酐、血尿酸和血纖維蛋白原的水平明顯升高（均P＜0.001），eGFR值顯著下降（P＜0.001）。AKI組患者使用利尿劑人數高于非AKI組（P＜0.001）。AKI組患者收縮壓高于非AKI組（P＜0.001），舒張壓兩組差異無統計學意義。其他指標如年齡、病程、尿蛋白定量、血總膽固醇、血低密度脂蛋白膽固醇和血纖維蛋白原等，兩組比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表1。

表1 兩組患者的基線情況比較（±s）

組別年齡/歲月使用利尿劑/%收縮壓/mmHg舒張壓/mmHg尿蛋白定量/（g/24 h）血漿清蛋白/（g/L）AKI組（n=33）31.2±7.929/143.21±2.2248.48%137±2184±135.22±2.0718.83±3.66非AKI組（n=24）33.1±9.224/103.58±1.6420.83%125±1982±115.55±2.5719.56±4.97 P值0.3350.297＜0.001＜0.0010.1130.2850.166男/女病程/組別血總膽固醇/ mmol/L血低密度脂蛋白膽固醇/(mmol/L）纖維蛋白原/(g/L）血尿酸/(μmol/L）血肌酐/(μmol/L)血Cys C/(mg/L）eGFR/[ml/（min·1.73 m2）]尿PCX/(ng/ml）AKI組（n=33）8.85±3.126.67±2.656.87±1.74498.36±175.73 194.38±31.011.91±0.5421.33±8.8542.04±11.01非AKI組（n=24）9.21±2.647.80±2.994.59±1.57396.57±165.7874.38±9.521.29±0.3484.07±10.5130.88±9.93 P值0.0970.102＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.2各項指標與急性腎損傷嚴重程度相關性分析

隨著急性腎損傷病情加重，尿PCX、血Cys C和血肌酐逐漸升高（P＜0.05），尿PCX、血Cys C和血肌酐隨著eGFR的減少呈負相關（其中，尿PCXr= -0.553，P＜0.001；血Cys Cr=-0.78，P＜0.001；血肌酐r=-0.867，P＜0.001）。見圖1～3。

2.3各項指標與急性腎損傷嚴重程度（AKI分期）單因素方差分析

把33例合并急性腎損傷患者，根據KDIGO關于AKI指南的診斷和分期標準分為AKI1期、2期和3期，比較各期患者尿PCX、血Cys C和血肌酐值的差異性。結果表明急性腎損傷腎功能受損程度越高，患者尿PCX、血CysC和血肌酐值的水平也越高，各期比較差異均有統計學意義（P＜0.05），見表2。

進一步兩兩比較發(fā)現，AKI 3期與1期比較差異有統計學意義（P=0.001）、AKI 3期與2期差異有統計學意義（P=0.009），但AKI 2期與1期之間差異無統計學意義（P=0.063）；Cys C指標AKI各期之間差異有統計學意義（P=0.001），進一步兩兩比較發(fā)現，AKI 1期與3期差異有統計學意義（P= 0.001），但AKI 2期與1期（P=0.090）、AKI 3期與2期之間差異無統計學意義（P=0.136）。

表2 合并急性腎損傷患者腎功能狀況與各指標之間的關系（±s）

注：1）與1期比較，P＜0.05，2）與2期比較，P＜0.05

AKI分期血肌酐/（μmol/L）1期（n=14）185.59±28.372）2期（n=10）278.53±43.151）3期（n=9）366.37±34.241）2）尿PCX/（ng/ml）血Cys C/（mg/L）34.5±7.922）1.58±0.422）42.11±6.601）1.94±0.351）53.68±9.041）2）2.38±0.551）2）

3 討論

AKI是原發(fā)性腎病綜合征的常見并發(fā)癥之一。長期以來血肌酐、尿素氮一直是作為反映腎損傷最主要的生物標志物，但上述兩項具有局限性，主要原因：血肌酐和尿素氮的水平升高常發(fā)生于腎損傷后數天至數周，無法監(jiān)測腎臟的早期病變；血肌酐和尿素氮的血液蓄積只與腎小球濾過率下降相關，并不能反映腎小管的損傷、壞死；血肌酐和尿素氮水平變化容易受年齡、性別、種族、飲食、身體狀況及藥物等多因素的影響，不能真實反映早期腎功能受損情況[2-3]。所以，倘若單純依靠血肌酐、尿素氮的檢測可能延誤AKI的早期診斷及治療。

足細胞位于腎小球毛細血管壁最外層，以其次級突起即足突和基底膜相連，足突間有裂隙隔，其上覆蓋的裂隙隔膜是構成腎小球血液濾過屏障的主要成分。足細胞受損后從腎小球基底膜脫落破壞濾過膜的完整性，是蛋白尿發(fā)生的病理基礎之一。足細胞的破壞反映了腎小球的損害程度[4-5]。足細胞的足突和裂隙隔膜的多個蛋白分子逐漸被認識，PCX是足細胞表達的一種特異蛋白分子，其正常表達能防止帶負電荷的蛋白分子漏人原尿中。VITUREIRA等認為尿液PCX可監(jiān)測腎小球損傷的活動性，認為尿沉渣PCX水平是評估急性腎小球損傷的嚴重性的可靠實驗室指標[6]。有研究表明糖尿病患者尿PCX水平較健康人組明顯增高，且隨著病情加重，糖尿病病程的延長，其尿PCX水平出現明顯的增加[7]。亦有研究表明，IgA腎病病程中尿足細胞陽性預示病情進展，而陰性則標志著病情穩(wěn)定或緩解[8]。本研究證實原發(fā)性腎病綜合征合并AKI患者，尿中可以檢測到尿足細胞標志蛋白PCX。在PNS合并AKI組中尿PCX較對照組明顯增高，說明尿足細胞標志蛋白是AKI的良好標志物。為了觀察急性腎損傷的嚴重程度與尿足細胞標志蛋白是否有相關性，本研究設置了AKI不同分期組比較觀察尿足細胞標志蛋白，研究顯示隨著急性腎損傷程度的逐漸加重，尿PCX濃度逐漸升高，在急性腎損傷3期與1、2期差異有顯著性，但1期與2期差異無顯著，提示尿足細胞標志蛋白對AKI嚴重程度及預后評估有重要作用。尿PCX為無創(chuàng)性檢查，且簡單、快捷。

1983年ANASTASI等首次在雞蛋清中分離到高純度的半胱氨酸蛋白酶抑制劑（cysteine proteinase inhibitor，CPI），之后被命名為胱抑素C。它能在幾乎所有的有核細胞內以恒定的速度持續(xù)地轉錄與表達，無組織學特異性，故在體內以恒定速度產生[9]。循環(huán)中的胱抑素C僅經腎小球濾過而被清除，是一種反映腎小球濾過率變化的內源性標志物，并在近曲小管重吸收，但重吸收后被完全代謝分解，不返回血液，因此，其血中濃度由腎小球濾過決定，而不依賴任何外來因素，如性別、年齡、飲食的影響，是一種反映腎小球濾過率變化的理想同源性標志物。目前大量研究資料已顯示，Cys C比BUN、血Cr具有更高的敏感性和特異性，在評價腎小球濾過率中具有重要的價值，已被公認為是腎功能早期損傷的標志物之一。本研究顯示在PNS合并急性腎損傷時血Cys C明顯升高，AKI組和對照組有顯著性差異。同時本研究觀察在AKI不同分期中的血Cys C水平，顯示AKI1期與AKI3期有顯著差異，但相鄰兩期差異無顯著，隨著急性腎損傷病程進展，血Cys C水平呈現逐漸升高趨勢。血中Cys C對PNS合并AKI的診斷及病情觀察具有重要的臨床意義

理論上PNS患者ALB越低，血管內有效血容量相對不足，腎間質水腫越明顯，加重腎損傷。近年來對于高脂加重腎小球進行性硬化的作用十分受重視。本研究同時觀察血LDL-C、ALB水平與急性腎損傷的關系，發(fā)現上述指標在急性腎損傷組與對照組之間，及急性腎損傷各期間無顯著差異。本研究提示PNS中血脂與血白蛋白的水平與AKI無相關性。

本組病例分析中還可觀察到利尿劑的不適當使用可能是導致急性腎損傷的一個原因。由于腎病綜合征患者因低蛋白血癥往往腎臟有效血容量不足，此時若不適當地過度利尿，將導致腎臟血流灌注明顯減少，從而影響腎小球濾過率，促進急性腎損傷的發(fā)生。

綜上所述。在PNS患者中，聯合檢測尿PCX和血清胱抑素可以為PNS合并AKI的防治提供依據。通過本實驗研究結果表明，對PNS患者檢測尿PCX、血Cys C有助于及早發(fā)現AKI，并反映AKI病情嚴重程度。上述兩項檢測指標具有無創(chuàng)、可操作性強、敏感等特點，有助于了解PNS合并AKI的發(fā)病機制，也為臨床預測PNS中AKI提供新的檢測指標。

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Urinary podocalyxin as a marker of primary nephrotic syndrome complicated with acute kidney injury

Fu-zhen WANG1,Zhao-wen QIU1,Jie ZHU2,Sen-chao WU1,Chong-yun LIN1,Chao-hui WANG3
(1.Department of Nephrology,the First Hospital of Lonyan,Fujian Medical University,Longyan, Fujian 364000,P.R.China;2.Mathematics and Science College,Shanghai Normal University, Shanghai 200234,P.R.China;3.Department of Nephrology,Ruijin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200025,P.R.China)

【Objective】To explore the diagnostic value of acute kidney injury(AKI)in the changes of primary nephrotic syndrome(PNS)patient's urine podocalyxin(PCX).【Methods】The concentration of urine PCX and serum CystatinC(CysC)and serum low density lipoprotein-cholesterol(LDL-C)and albumin(ALB)is detected in the group of PNS with AKI(n=33 cases)and the group of PNS without AKI(n=24 cases).Then we observe the relation between the index above-mentioned and the patient's condition.【Results】The urine PCX and serum CysC in the group of PNS with AKI are significant higher than the group of PNS without AKI.There is no significant difference of the serum LDL and ALB in the two groups.As the patient's condition become more serious and the estimation glomerular filtration rate(eGFR)become fewer,the increasing of urine PCX and serum CysC is more evident.【Conclusions】The conjoined detection of urine podocalyxin and serum CysC in the PNS patients is beneficial to early diagnosis and judgment of patient's condition of AKI.

urine;podocalyxin;nephrotic syndrome;acute kidney injury ?

R692

A

1005-8982（2015）28-0036-05

2015-06-03

林沖云，E-mail：lingchongyun@163.com