實時熒光定量PCR技術檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的研究進展

（青島農業大學動物科技學院，山東 青島 266109）

實時熒光定量PCR技術檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒的研究進展

范巖巖，張廷榮

（青島農業大學動物科技學院，山東 青島 266109）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）感染引起的一種高度接觸性傳染病，尤其是對母豬，該病毒嚴重影響其繁殖性能。實時熒光定量PCR以其快速、可靠的診斷技術，為檢測和診斷PRRSV開辟了新方法。文內對國內外實時熒光定量PCR技術在PRRSV研究中的應用作了綜述。

實時定量PCR；檢測；豬繁殖與呼吸綜合征病毒；鑒別診斷

實 時 熒 光 定 量PCR（Realtime PCR）技術 在1996年 由美國Applied Biosystems公司推出。該技術不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍，其與常規PCR相比，它具有特異性強、自動化程度高、能夠解決PCR污染問題等特點，目前已在生物學和醫學研究領域中得到廣泛應用。

1??實時熒光定量PCR的技術原理

Real-time PCR是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。一般而言，熒光擴增曲線可以分成3個階段：熒光背景信號階段、熒光背景信號指數擴增階段和平臺期。

1.1 工作原理

在PCR擴增時加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅熒光基團吸收；剛開始時， 探針結合在DNA任意一條單鏈上；PCR擴增時，Taq酶的5’端-3’端外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，只有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物的量形成完全同步[1]。

1.2 定量原理

在Real-time PCR反應的指數擴增階段，首先設定一定的熒光信號的域值，一般這個域值是以PCR反應的前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設置是3～15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍，若測到熒光信號超過域值，就被認為是真正的信號，可用于定義樣本的域值循環數Ct。Ct值的含義是：每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數，即PCR擴增過程中，熒光信號開始由于本底進入指數增長階段的拐點所對應的循環參數。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代表Ct值。只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數[2-4]。

1.3 熒光標記探針

目前國內外已經研究出幾種相關的技術，總體上可分為水解探針和雜交探針2類。水解探針有TaqManTM、TaqMan MGB、Universal probe library LNA等； 雜 交 探 針 有Scorpions TM/Amplifluor TM、Dual-oligo FRET pairs、Molecular Beacons、LUX等[5]。

2??實時熒光定量PCR技術在PRRSV上的定量檢測及診斷

2.1 PRRSV定量檢測

PRRS被認為是世界范圍內養豬業最為重要的傳染病之一，是由于受到PRRSV感染。2006年我國多個省份的養豬場出現了高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫情，使養豬業蒙受了重大的經濟損失。國外對此病毒作了較多的研究，如公豬感染PRRSV后，發現其精液品質下降，影響公豬繁殖性能[6-8]。因此如能在早期診斷中加以鑒別，采取相應的預防治療措施，對動物群體疫病的防治具有重要意義，但常規診斷方法由于其自身的缺陷很難滿足實際生產應用中的需要。常規PCR存在自身的缺點，其實驗周期長、成本高且容易發生交叉感染，導致無法對PRRSV準確定量，而實時熒光定量PCR技術不僅實現了對PRRSV的定性，而且還實現了對PRRSV的定量檢測。

國外學者E.Christoph[9]等報道了一種基于TaqMan技術的實時PCR，對PRRSV最低檢測量為1TCID50。黃娟等[10]在TaqMan技術基礎上建立了快速定量檢測PRRSV的Real-Time PCR方法，并用該方法檢測患病豬的肺臟等樣品，具有較高的特異性和重復性，設定PRRSV細胞培養物的檢測下限為0.01TCID50，比常規RT-PCR的敏感性高100倍，對10份PRRS疑似豬肺臟樣品檢測出5份為陽性，與病毒分離的陽性符合率為100%。建立的PRRSV實時PCR方法敏感性高，特異性強，操作方便快速，而且不容易造成分子生物學方面的污染，可為PRRSV診斷、感染和監測、進出口肉品安全檢測及PRRSV致病機理等基礎研究提供了有效手段。

對于高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（HP-PRRSV）的檢測，2008年Xiao等[11]建立了專門針對HPPRRSV的熒光定量RT-PCR方法，該方法敏感性可達到1個TCID50/ mL。但該方法不能檢測到經典美洲型PRRSV，也不能判定樣品是否有經典毒株和高致病毒株。楊宗照等[12]根據GenBank中的HP-PRRSV基因組序列設計特異性引物，建立一種基于SYBR GreenⅠ實時PCR檢測HPPRRSV的方法。結果表明，該方法能夠檢測到HP-PRRSV的存在，不與其他豬源病毒發生非特異性反應，標準曲線線性范圍覆蓋了 1×102～1×1011拷貝 /2 μL。與常規PCR方法相比，兩者的符合率100%。該方法具有快速、簡便、敏感等優點，具有重要的實用價值。

牛偉等[13]針對 PRRSV ORF5 結構蛋白基因設計了引物，應用 Realtime PCR 技術對不同疑似發病豬場采集的病料進行了檢測，對反應條件優化、繪制出 SYBR GreenⅠ熒光定量 PCR 標準曲線，并對其特異性、重復性進行分析。結果表明：標準曲線的線性度較好，PCR 的擴增效率也比較好，可見 Real-time PCR 檢測方法具有較高的可重復性，從而保證了不同樣品間檢測結果的可靠性和穩定性，將不同稀釋度的標準品 PRRSV分別進行 PCR 擴增，用統計學軟件分析表明，所建立的Real-time PCR 在組間和組內都具有良好的重復性(P＞0.05)，相關系數均大于0.99。陰性對照沒有出現特性擴增。用實時熒光定量PCR檢測方法檢測高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒及其變異株不僅特異性好、靈敏度高，且快速簡便。

2.2 PRRSV的鑒別及其診斷

該病自1987年首次報道發現于美國以來，現已遍及世界各主要養豬國家和地區。PRRSV可分為歐洲型和美洲型，二者基因組序列差異相對較大，分別以1991年荷蘭分離的LV和1992年美國分離的VR-2332為代表毒株。該病在我國呈蔓延趨勢，流行毒株為美洲型。國外學者M Spagnuolo-Weaver等[14]在2000年首先建立了檢測SYBR GreenⅠ熒光信號的歐洲型和美洲型PRRSV的熒光定量PCR方法來鑒別這2種抗原型。傳統診斷方法費時、準確性低，而多重 PCR 不僅保留了普通 PCR 特異性強、靈敏度高的優點且可在同一體系中擴增多個病原的基因片段，具有節約時間、節省人力物力等優點，能夠對疾病做到快速、準確的診斷，適合大量臨床樣品，特別是混合感染樣品中多種病原體的快速檢測[15-16]。

2006年春季以來，豬“高熱綜合征”在我國南方大部分地區流行，該病流行范圍廣、傳播速度快、持續時間長，蔓延到全國大部分地區。經查明導致該疫情的病原是HP-PRRSV。

Bernhard Z等 研 究 得 到HPPRRSV在Nsp2固定區域缺失90個核苷酸，這為實時熒光定量RT-PCR方法鑒別HP-PRRSV提供了理想位點。徐引弟等[17]參考PRRSV的Nsp2基因序列，在Nsp2大缺失區下游的保守區設計了1條下游引物，在小缺失區設計1條上游引物，用于變異株的擴增。在大缺失區內部設計1條上游引物，與變異株共用下游引物，用于普通株的擴增，建立了PRRSV變異株與普通株二重RT-PCR鑒別方法。建立的RT-PCR方法用于臨床病料的檢測，部分陽性結果測序，變異株序列與報道的序列同源性在97%以上。結果表明，該方法特異、快速、簡便，可以用于PRRSV變異株和普通株的鑒別。張文利等[18]在PPRSV的Nsp2基因和ORF7基因區域分別設計不同熒光標記的MGB探針及特異性引物。這2種探針能夠分別特異結合GDrl80疫苗株、GD野毒株。該方法一次檢測就能夠同時區別GDrl80株與其他病毒株，對疫苗的純凈性檢測、田間使用后的跟蹤及與野毒感染的鑒別檢測均具有重要作用。

2.3 多重實時熒光定量PCR的檢測

Wernike K等[19]建立了一種鑒別PRSSV變異型、美洲型和歐洲型的多重Real-time PCR，該方法敏感性高，能夠從樣品中檢測出少于200拷貝/ μL歐洲型PRRSV以及20拷貝/μL的美洲型和變異型PRRSV。施開創等[20]首次利用2對引物和3條探針，研究建立區分野毒株和TJM-F92疫苗株的多重TaqMan熒光定量RT-PCR，為PRRSV美洲型野毒株、疫苗株的快速鑒別檢測及流行病學調查提供了有效的技術手段。 曲哲會等[21]根據GenBank中登陸的PRRSV經典株、HP-PRRS株和CSFV（豬瘟病毒）基因組全系列，分別設計了2對特異性引物，建立了實時熒光定量PCR檢測方法，可同時對PRRSV和CSFV進行檢測，同時可以鑒別PRRSV經典株和HP-PRRSV株，為2種疫病的鑒別和混合感染的診斷提供了一種病原快速檢測的方法。該方法特異性的檢測PRRSV經典株、HPPRRS株和CSFV，具有良好的特異性。

3??存在的問題

實時熒光定量PCR技術優點很多，但是在Real-time PCR技術中，無論是相對量還是標準曲線定量方法都存在著一些問題：

1）在標準曲線定量中，標準品的制備是一個必不可少的過程，目前由于無統一標準，各個實驗室所用的生成標準曲線的樣品不相同，致使實驗結果缺乏可比性；

2）Real-time PCR用 于 研 究mRNA時，受到不同RNA樣本和不同逆轉錄效率的限制；

3）運用封閉式的檢測，減少了擴增后電泳的檢測步驟，無法確定擴增產物的大小；

4）由于熒光素種類以及檢測光源的局限性，從而相對地限制了Realtime PCR檢測應用能力；

5）自動化儀器和試劑成本比較高。

4??發展前景

隨著技術不斷改進和發展，目前實時熒光PCR技術已成為科研的主要工具，一方面實時熒光定量PCR技術與其他分子生物學技術相結合使定量極微量的基因表達或DNA拷貝數成為可能。此外， Real-time PCR技術在動物檢疫和環境監測等方面也得到了廣泛的應用，該技術未來的應用前景是令人鼓舞的。

實時熒光PCR技術的發展使得研究人員又多了一種比較簡單且自動化的手段去研究許多重要的基礎課題。雖然此技術仍存在一些不足需要改進，但是它為實時熒光PCR技術在常規診斷檢測中的運用打下了良好的基礎，實時熒光PCR技術將成為未來分子生物學實驗室必備的研究工具。它為研究PRRSV 提出了新思路，實現了對PRRSV進行較準確的定量，也為PRRSV與其混合感染的診斷提供了一種新途徑。

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