豬圓環病毒2型復制與轉錄模式研究進展

王偉丞，梁海英，曾智勇，湯德元，劉 釗,代振江

（1.貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025）

豬圓環病毒2型復制與轉錄模式研究進展

王偉丞，梁海英，曾智勇*，湯德元，劉 釗,代振江

（1.貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025）

豬圓環病毒是一種單股負鏈環狀DNA病毒，有PCV1和PCV2兩種血清型，PCV1一般認為無致病性，而PCV2是導致斷奶仔豬多系統衰竭綜合癥的重要病原，給養豬業造成了巨大的經濟損失。PCV復制模式為坩堝滾環復制，須依賴于Rep和Rep，蛋白的共表達、病毒復制起始區和雙鏈DNA片段的形成，三者缺一不可；其轉錄模式也較為復雜，可雙向進行且通過選擇性剪切從而產生不同的RNA。主要對PCV2復制模式和轉錄模式等方面進行綜述，以期為PCV的相關研究提供借鑒和參考。

豬圓環病毒；基因組結構；復制模式；轉錄模式

豬圓環病毒(PCV)屬于圓環病毒科，圓環病毒屬，是一種非常小的無囊膜的單股環狀負鏈DNA病毒。1974年由Tisher等在PK-15細胞中首次發現豬圓環病毒1型（PCV1）[1]，其在豬群中廣泛存在，一般認為無致病性，但Saha等研究表明PCV1對豬的胚胎有一定致病性[2]。1991年，在加拿大從斷奶仔豬多系統衰竭綜合征（PMWS）的患豬中分離到一種新病毒，該病毒與PCV1非常類似，但在抗原和基因上存在較大差異，因此被稱為豬圓環病毒2型（PCV2）[3]。PCV2引起的各種疾病給世界養豬業造成巨大的經濟損失，受到國內外學者的高度重視。目前，該病在世界范圍內流行，死亡率在10%～30%不等，現已被世界各國的獸醫和養豬業者公認為本病是繼豬繁殖與呼吸綜合征之后新發現的重要豬傳染病[4]。本文就PCV2近年來復制與轉錄模式相關研究進行了綜述。

1??PCV2復制模式研究

PCV的基因組以坩堝滾環模式進行復制。在復制過程中，病毒首先產生雙鏈(DS)的復制型中間體(RF)。該復制型中間體DNA的2條鏈都能進行基因轉錄和蛋白質的表達。PCV2的復制起始區含有1個發夾結構和1個保守的八核苷酸基序A1X2T3A4X5T6↓A7C8（↓為缺口切割位點），這2個結構是病毒滾環復制過程中病毒正鏈合成的起點[5]。研究證實，PCV2的復制起始區位于一個324 bp的片段上，該片斷位于PCV2基因組的1 635～195 bp處，在PCV2的復制起始區包含1個莖環結構、保守的八核苷酸基序、3個六核苷酸重復序列(CGGCAG)和2個五核苷酸重復序列，Rep和Rep’的共表達同樣也是起始PCV2的復制所必須的，單獨的PCV2 Rep和Rep’也不能起始PCV2的復制。用突變法對PCV2的保守八核苷酸基序進行研究表明，PCV2復制起點的八核苷酸基序是病毒蛋白合成、DNA復制和子代病毒穩定產生的必需核心元件[6]。滾環復制模型一般如下：

1.1?單鏈DNA變為雙鏈DNA

單鏈 DNA病毒基因組變成雙鏈中間體并形成超螺旋作為病毒 DNA 合成的模板。這種機制和細菌質粒復制相似，已經證明只有超螺旋分子能夠作為RCR起始的模板。單鏈變成雙鏈基因組需要負鏈引物來起始新生互補鏈DNA的合成。在雙粒病毒和納米病毒中，負鏈引物由DNA或者是包裝在病毒中的5’端有幾個核糖核酸組成，或者是病毒感染后宿主細胞中合成的一個RNA引物。這些引物位于復制起始區或者終止序列基因間區域。但PCV負鏈基因組引物還沒有得到證實。

1.2?病毒基因組復制的起始和延伸

PCV基因組的復制要求Rep復合物和順式作用元件，在復制起始位點相互作用。當Rep復合物結合到Rep和Rep’的最小結合位點上后，使得雙鏈超螺旋構象發生變化，導致環部結構的八核苷酸基序暴露為單鏈DNA，緊接著被Rep和Rep’蛋白識別并在T6與A7之間切割。一般認為是Rep蛋白而不是Rep’具有解開雙鏈八聚核苷酸的作用，因為Rep蛋白含有1個解旋酶P環結構。T6與A7之間的磷酸二酯鍵斷裂是由Rep蛋白的RC-III中的93位酪氨酸 (Tyrpe)的羥基發起親核性攻擊而導致的，該切割活性依賴于二價陽離子，不依賴于ATP的水解作用或回文序列[7]。在雙鏈被切開后，Rep蛋白通過自身酪氨酸磷脂鍵結合到DNA鏈5’末端，由此產生了一個游離的3’—OH末端。接著由宿主的DNA聚合酶以新形成的3’—OH末端作為引物單向起始新DNA合成及延伸。體外研究表明Rep蛋白和Rep’蛋白都能通過酪氨酸殘基切割斷裂八核苷酸并共價結合到移位的DNA上。現已明確介導切割作用的分子就是共價結合到移位的DNA上，但還沒有直接的證據詳細說明是Rep蛋白還是Rep’蛋白能夠在PCV基因組起始位點結合并介導DNA切割。

新產生的 3’-OH 末端作為第1輪 DNA合成的引物。Rep 和Rep’蛋白都沒有聚合酶的作用，初期 DNA的延伸合成是由宿主細胞內酶分子來主導完成的。如果超螺旋構像對PCV基因組復制的起始是必須的，那么處于復制中的基因組將不能起始另一輪DNA的復制，直到第1輪基因組合成完成。

1.3?病毒基因組復制的終止

目前關于PCV前導鏈合成精確的終止機制還沒有確定，現有2種可能的機制。

1）當新生DNA鏈完全合成及親本DNA鏈完全被替代時，Rep蛋白復合物中的Rep’蛋白在模板鏈T6與新生DNA鏈的A7之間切割，之后Rep’蛋白共價結合到新生DNA鏈5’末端，從而形成了親本鏈游離的3’-OH末端。這次親核性攻擊導致了親本環狀單鏈DNA的釋放，并形成了帶有Rep，蛋白共價結合的新生DNA鏈。隨后新生鏈的3’-OH末端對含有Rep’蛋白的新生DNA鏈5’端發起親核性攻擊，從而重新形成八聚核苷酸并釋放Rep復合物和含一條新生鏈的雙鏈復制中間體DNA。利用該機制終止所形成的雙鏈復制中間體DNA分子存在一不相容的回文結構，并永不能再與Rep蛋白復合物共價。

2）如果第1輪DNA合成之后越過切割位點，那么這種終止的機制則與pT181質粒的滾環式復制終止模型相似。在該機制中Rep復合物可能會進行2次分開的切割/連接作用(先是Rep’蛋白再是Rep蛋白)，結果產生一條單鏈環狀親本DNA，一條含新生鏈的雙鏈中間體DNA及一含約10～12個核苷酸序列的Rep復合物（SP-Rep 蛋白復合體）。由于Rep蛋白和Rep’蛋白都能在回文序列缺失的情況下執行切割功能，所以在反向重復序列錯配情況下，仍然可以進行切割作用，但是釋放的親本單鏈DNA為線狀且與Rep復合物共價結合。由此形成的雙鏈中間體DNA分子還有功能，而且如果新生DNA鏈恢復了正確的序列配對，那么該雙鏈中間體DNA分子可以在接下來的DNA復制中產生有活力的基因組。該機制可以充分說明含有錯配互補重復序列的雙鏈PCV基因組質粒能夠產生有活性的子代病毒。

2??PCV2轉錄模式研究

PCV基因組的轉錄模式非常復雜。轉錄是雙向進行的并且通過選擇性剪切產生不同的RNA。PCV1和PCV2的轉錄起始和終止信號在基因組上的位置相當，但是它們在特定RNA表達水平及剪切點選擇上有所不同。己有報道，在PK-15細胞的病毒復制過程中，PCV1編碼13種RNA，包括1個衣殼蛋白 RNA、8個Rep 相關 RNA (分別 為 Rep、Rep’、Rep3a、Rep3b、Rep3c-1、Rep3c-2、Rep3c-3、Rep3c-4)、3個NS相關RNA (分別為NS462、NS642、NS0)及ORF3-RNA；而PCV2編碼10個RNA，分別為1個衣殼蛋白RNA、5個Rep相 關 RNA (分 別 為 Rep、Rep’、Rep3a、Rep3b、Rep3c)、3 個 NS 相關 RNA(分別為NS515、NS672、NS0)及ORF3-RNA，其中Rep相關RNA擁有相同的5’端和3’端核苷酸序列，這可能說明這些RNA是從全長Rep基因中通過選擇性剪切而形成的[9]。Rep相關RNA與NS相關RNA的3’端核苷酸序列也相同。通過基因組分析比較發現，PCV1和PCV2的Rep、Rep’、Rep3a、Rep3b和NS0基本上相同，但是Rep3c及NS相關RNA卻因剪接點不同而在數量上和性質上有所差別，突變結果表明，Rep和Rep’是病毒復制必須的蛋白。

編碼的復制酶蛋白、病毒衣殼蛋白及凋亡相關蛋白功能已進行了鑒定，但這些較小的RNA能否編碼蛋白及它們在病毒生命循環中的功能尚不明確。ORF1經不同的剪輯，編碼2個病毒復制相關蛋白，Rep和Rep’，Rep和Rep’蛋白與基因間區域5’端復制原點內的特異性序列結合，為病毒復制必需的。ORF2編碼病毒的Cap蛋白，與病毒和宿主細胞受體結合有關。Cap蛋白包裹單股環狀病毒基因組形成感染性的病毒粒子，并將在復制酶蛋白Rep和Rep’從細胞漿轉運到細胞核進行病毒DNA復制起重要作用，PCV2衣殼蛋白是病毒主要的免疫原蛋白，是疫苗研發和PCV2特異性血清學診斷的靶蛋白。此外，ORF3編碼的相關蛋白具有一定的致病性，能誘導細胞凋亡[8]。

3??結語

PCV2是嚴重的免疫抑制性疫病，給養豬業帶來了嚴重的危害。近年來對PCV的復制和轉錄機理相關研究成為熱點，也取得了很多成就，但關于PCV基因組復制過程中Rep’蛋白具體的生物學功能，PCV負鏈基因組的引物，宿主細胞內的DNA復制相關蛋白如何被激活、記憶、復制、終止的確切機制等仍需深入和系統的研究，以期為抗PCV的藥物的開發及疫苗的研制提供更多重要的理論依據。

[1] Tischer I，Rasch R，Tochtermann G.Characterization of papovavirusand picornavirus-like particles in permanent pig kidney cell lines [J]. Zentralbl Bakteriol Orig A，1974，226(2)： 153-167.

[2] Saha D，Lefebvre D J，Ducatelle R，et al. Outcome of experimental porcine circovirus type 1 infections in mid-gestational porcine foetuses [J]. BMC Vet Res，2011（7）： 64.

[3] Allan G M，Mcneilly F，Kennedy S，et al. Isolation of porcine circoviruslike viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe [J]. J Vet Diagn Invest，1998，10(1)： 3-10.

[4] 王憲文，姚四新，王麗榮，等. 豬圓環病毒Ⅱ型流行病學新特點及致病機理研究進展[J]. 中國畜牧獸醫，2012，39(12)： 190-194.

[5] Cheung A K. Porcine circovirus：Transcription and DNA replication [J]. Virus Res，2012，164(2)：46-53.

[6] Cheung A K.Identification of an octanucleotide motif sequence essential for viral protein，DNA，and progeny virus biosynthesis at the origin of DNA replication of porcine circovirus type 2[J].Virology，2004，324(1)：28-36.

[7] Steinfeldt T，Finsterbusch T，Mankertz A. Functional analysis of cis- and trans-acting replication factors of porcine circovirus type 1[J].J Virol，2007，81(11)：5696-5704.

[8] 李鵬，王利平，朱艷平，等. 豬圓環病毒2型靶細胞及其受體的研究進展[J].中國畜牧獸醫，2013，40(1)： 25-28.

2014-03-28）

“攜帶遺傳標記的豬圓環病毒反向遺傳操作平臺的構建”[黔科合LH字（2014）7670]；貴州省農業科技攻關項目“貴州省規模化豬場豬繁殖障礙性疫病防控體系的研究與示范”[黔科NY(2010)3042]

王偉丞（1990—），男，在讀碩士，研究方向：動物傳染病病原分子生物學。

曾智勇（1978—），男，教授，博士，碩士生導師，從事動物傳染病病原分子生物學研究。