大鼠生后發(fā)育過程中腦細(xì)胞外間隙的解剖及生理特性的變化

楊雙風(fēng)，韓鴻賓，彭 蕓

(1．首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院影像中心，北京 100045;2．北京大學(xué)第三醫(yī)院放射科，北京 100191;3．磁共振成像設(shè)備與技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191)

腦細(xì)胞外間隙(extracellular space，ECS)是存在于細(xì)胞之間不規(guī)則的，且相互連通的狹窄空隙，有學(xué)者稱之為組織通道［1－2］。ECS之間填充著細(xì)胞間液(interstitial fluid，ISF)，其與腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)成分類似，但存在不同，ISF中還含有由長鏈大分子組成的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，它們浮在ECS中，可以與細(xì)胞膜附著或完全游離。ECS、ISF和ECM共同構(gòu)成了腦細(xì)胞微環(huán)境(brain extracellular microenviroment，BEM)，其 中ECS更被強(qiáng)調(diào)是BEM最重要的組成部分，在保證腦細(xì)胞間電信號(hào)傳導(dǎo)的穩(wěn)定性，形成細(xì)胞與血液之間物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)通道，以及神經(jīng)突觸重塑過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

神經(jīng)元之間的相互作用通過突觸傳遞和ECS中神經(jīng)活性物質(zhì)的擴(kuò)散來實(shí)現(xiàn)。而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞沒有突觸，其與神經(jīng)元的交流只能通過ECS中離子和神經(jīng)活性物質(zhì)的擴(kuò)散來實(shí)現(xiàn)。神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞均可釋放離子、遞質(zhì)和其他各種神經(jīng)活性物質(zhì)，它們的擴(kuò)散常超過一個(gè)突觸，到達(dá)離釋放點(diǎn)更遠(yuǎn)的距離。物質(zhì)通過ECS擴(kuò)散并結(jié)合到突觸外通常是高度聯(lián)系的，結(jié)合點(diǎn)位于神經(jīng)元、軸突和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。這種類型的非突觸傳遞也稱為突觸外傳遞或容量傳遞(神經(jīng)活性物質(zhì)在ECS空間內(nèi)運(yùn)動(dòng))［3］。突觸傳遞是傳統(tǒng)的一對(duì)一聯(lián)系，而突觸外傳遞是一對(duì)多的聯(lián)系。因此，細(xì)胞外間隙是神經(jīng)元、軸突和膠質(zhì)細(xì)胞之間突觸外傳遞的信息通道。此外，ECS中的擴(kuò)散對(duì)于突觸傳遞和神經(jīng)元興奮性也同樣重要。

ECS擴(kuò)散參數(shù)是不穩(wěn)定的，在生理狀態(tài)如發(fā)育、老化、神經(jīng)元活動(dòng)或特定生理?xiàng)l件下如哺乳，可以發(fā)生顯著的變化，這與結(jié)構(gòu)的改變?nèi)缒z質(zhì)增生、星形膠質(zhì)細(xì)胞的重排過程和細(xì)胞外基質(zhì)的缺失有關(guān)。ECS也是不均勻的，擴(kuò)散性能在微觀水平如不同類型細(xì)胞周圍，以及宏觀水平如不同腦區(qū)之間是不同的。

1 腦ECS測(cè)量方法及其基本參數(shù)的定義與意義

1.1 腦ECS測(cè)量方法

目前，針對(duì)神經(jīng)元生存的微環(huán)境的測(cè)量技術(shù)可分為三類，腦ECS局部測(cè)量技術(shù)，腦ISF分析技術(shù)，腦ECS與ISF成像測(cè)量技術(shù)。

1.1.1 腦ECS局部測(cè)量技術(shù):針對(duì)腦ECS的測(cè)量方法主要包括選擇性微電極法(ion-selective microelectrodes，ISMs)［4］，集 成 光 學(xué) 成 像 法(integrativeoptical imaging，IOI)［5－6］，最常用的是實(shí)時(shí)離子導(dǎo)入法(real time iontophoresis，RTI)，用來監(jiān)測(cè)四甲基銨離子(tetramethyl-ammonium，TMA+)濃度的變化，即RTI-TMA+技術(shù)。

1.1.2 腦ISF分析技術(shù):針對(duì)ISF內(nèi)容物進(jìn)行分析主要集中在腦ISF溶質(zhì)成分、含量及其理化性狀［7］，如組織間液壓力、pH值、流動(dòng)速率等;另外一個(gè)重要的方向就是ISF引流途徑。

1.1.3 腦ECS與ISF成像分析技術(shù):放射性示蹤法［3］，免疫組織化學(xué)染色［8］，激光掃描共聚焦顯微成像技術(shù)［9－10］在研究腦 ISF引流途徑中的應(yīng)用越來越廣泛，如在體雙光子成像技術(shù)、多光子激光掃描系統(tǒng)。磁共振成像分子示蹤技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)腦ECS、ISF的同時(shí)定量分析與測(cè)量，并實(shí)現(xiàn)了包括腦深部的三維可視化在活體的測(cè)量技術(shù)［11－13］。

1.2 腦ECS基本參數(shù)的定義及其在發(fā)育中的變化

中樞神經(jīng)系統(tǒng)ECS中許多神經(jīng)活性物質(zhì)的擴(kuò)散效能取決于各種物質(zhì)的大小、電荷、形狀、結(jié)構(gòu)以及ECS的物理-化學(xué)性能，后者隨著某一特定腦區(qū)的組織結(jié)構(gòu)不同而不同，如在不同腦區(qū)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程、神經(jīng)活動(dòng)、激素釋放、年齡增長和許多病理狀態(tài)下［14］。而且，在同一條件下，ECS內(nèi)分子的遷移受擴(kuò)散屏障引導(dǎo)，因此擴(kuò)散被限制在某一特定方向，這就是說，某一腦區(qū)的擴(kuò)散是各向異性的［15］。物質(zhì)在ECS擴(kuò)散的基本限制因素是ECS容積分?jǐn)?shù)(α:神經(jīng)組織允許物質(zhì)擴(kuò)散的有限容積)和ECS迂曲度(λ:擴(kuò)散物質(zhì)在兩個(gè)點(diǎn)間由于各種障礙而增加的路徑，如細(xì)胞膜及可能的長鏈糖蛋白和混合的物質(zhì))［4］。除了容積分?jǐn)?shù)和迂曲度，物質(zhì)向其他細(xì)胞的擴(kuò)散可以被非特異性的濃度依賴性的細(xì)胞攝取(k，)所影響［4］，k，反映了物質(zhì)從 ECS 進(jìn)入細(xì)胞、穿過血腦屏障或經(jīng)過其它過程的清除或丟失。

ECS容積、迂曲度和各向異性的改變可以顯著影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)活性物質(zhì)的聚集和擴(kuò)散，從而影響神經(jīng)-膠質(zhì)的信息交流、膠質(zhì)細(xì)胞突起與突觸的空間關(guān)系、谷氨酸鹽或γ-氨基丁酸“溢出”的效能和突觸的串連、細(xì)胞移動(dòng)、激素的作用和神經(jīng)活性物質(zhì)的毒性效應(yīng)，并且對(duì)于診斷、藥物傳遞和新的治療方法的建立非常重要［16］。

1.2.1 ECS容積分?jǐn)?shù)

ECS容積分?jǐn)?shù)α定義為ECS容積/總腦組織容積。早期使用冷凍置換固定方法試圖保留ECS的電鏡技術(shù)顯示，生后10 d鼠皮層的α值為41%并隨著發(fā)育成熟而下降，成年時(shí)為22%［16］。傳統(tǒng)的鼠下丘固定提示生后1 d鼠的α值為15%，在成年時(shí)降至8%［17］。這項(xiàng)研究中報(bào)道的ECS的下降是由傳統(tǒng)的電鏡技術(shù)觀察到的，其隨發(fā)育成熟逐漸變小的趨勢(shì)是很明顯的。由于很難用電鏡技術(shù)保留ECS，所以現(xiàn)在常利用擴(kuò)散技術(shù)來重新觀察其大小。

Lehmenkuhler等［18］運(yùn)用 RTI-TMA+方法在鼠腦皮層進(jìn)行一項(xiàng)廣泛的研究，證實(shí)生后2～4 d α值為40%，但是在生后 10～11 d，α值為 27%，這與Bondareff和 Pysh［16－17］發(fā)現(xiàn)的值相反，并且之后 α值穩(wěn)定減小，至生后23 d達(dá)20%，相當(dāng)于成年水平，這與皮層的伸展和神經(jīng)膠質(zhì)形成過程相一致。

此外，生后發(fā)育過程中個(gè)體皮層灰質(zhì)的不同層面和白質(zhì)內(nèi)擴(kuò)散參數(shù)的改變是不一致的［18］。生后2～3 d的動(dòng)物，皮層Ⅲ和Ⅳ的α值(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)是0.36±0.04，皮層Ⅴ是0.38±0.02，皮層Ⅵ是0.41±0.01，白質(zhì)是0.46±0.01。α值最早降低是在生后6～7 d時(shí)出現(xiàn)在皮層Ⅴ和Ⅵ，在生后8～9 d皮層Ⅲ和Ⅳ降低，在生后10～11 d白質(zhì)降低。α值的進(jìn)一步顯著減少出現(xiàn)在生后10～21 d之間，全腦皮層特別是白質(zhì)的α值迅速減小。生后21 d至成年時(shí)期(90～120 d)α值再無進(jìn)一步降低。成年后α值在皮層Ⅱ －Ⅵ及白質(zhì)分別為:0.19±0.002、0.20±0.004、0.21 ±0.003、0.22 ±0.003、0.23 ±0.007和0.20±0.008。相似的，通過 DWI方法發(fā)現(xiàn)水的表觀擴(kuò)散系數(shù)(ADCw)在生后皮層及白質(zhì)發(fā)育中顯著降低［19］，可以提示，ADCw的降低與 ECS大小的改變有關(guān)。

ECS容積分?jǐn)?shù)在腦發(fā)育過程中的上述改變有其特定的生理基礎(chǔ)。較大細(xì)胞外間隙的出現(xiàn)伴隨著大量樹突和軸突的生長而細(xì)胞外間隙的變小則伴隨著復(fù)雜細(xì)胞聯(lián)系的發(fā)展［20］?；屹|(zhì)的總厚度在生后第一個(gè)15 d幾乎是翻倍的，這是神經(jīng)元大量生長和遷移的階段，其間膠質(zhì)纖維酸性蛋白mRNA經(jīng)歷兩次發(fā)育表達(dá)，灰質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量膠質(zhì)。而ECS容積從出生至生后15 d(星形細(xì)胞增殖期)增加，隨后開始下降直至生后55 d(星形細(xì)胞變形分化期)［21］。因此，星形細(xì)胞增殖期與生后灰質(zhì)ECS容積分?jǐn)?shù)降低的時(shí)間進(jìn)程相一致。然而，白質(zhì)的厚度從生后15～21 d開始增加，相應(yīng)的，其α值的第一次顯著降低的時(shí)間也晚于皮層，生后10～11 d白質(zhì)的α值幾乎是生后20 d及以上鼠腦白質(zhì)的兩倍，這提示α值在廣泛髓鞘化階段迅速下降，這發(fā)生在生后第2～3周尤其是第3周。在生后21 d以后，灰質(zhì)和白質(zhì)α值保持不變。因此，細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外容積的比值在腦發(fā)育成熟過程中是發(fā)生變化的，總腦容積的增加是由細(xì)胞密度的增加、細(xì)胞移行、軸突生長、樹突萌芽和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞成熟引起的。皮層灰質(zhì)及皮層下白質(zhì)的生長和成熟與ECS容積分?jǐn)?shù)的減小呈負(fù)相關(guān)。

1.2.2 迂曲度

ECS的迂曲度λ定義為(D/D*)1/2，D表示自由擴(kuò)散系數(shù)，D*表示物質(zhì)在神經(jīng)組織中的擴(kuò)散系數(shù)。迂曲度代表擴(kuò)散屏障的大小和數(shù)量，健康成年動(dòng)物腦組織的λ約為1.6，這表示物質(zhì)在大腦內(nèi)的擴(kuò)散比在自由介質(zhì)慢2.6倍［22］。這只在分子或離子遠(yuǎn)小于ECS的寬度時(shí)適用，對(duì)于大分子，λ是增大的，一部分原因是大分子在通過ECS時(shí)與其狹窄通道壁的接觸頻率增加［23］。

迂曲度的主要影響因素有兩個(gè):幾何構(gòu)型和細(xì)胞外基質(zhì)。要討論ECS的幾何構(gòu)型需要意識(shí)到ECS在某種意義上是一個(gè)連接良好的區(qū)域，在任何兩個(gè)相隔幾十微米的位置之間，有多條路徑可以通過ECS。當(dāng)分子在兩點(diǎn)之間的運(yùn)動(dòng)被迫通過更迂曲的路徑時(shí)，運(yùn)動(dòng)時(shí)間將會(huì)增加，導(dǎo)致D*減小，而λ增大。關(guān)于生后發(fā)育過程中迂曲度的變化趨勢(shì)尚不明確，有研究顯示從生后2～4 d至成年，λ值保持在1.5～1.6范圍內(nèi)［4］，而對(duì)于這一結(jié)果產(chǎn)生的機(jī)制卻缺乏充分的依據(jù)。在某些病理狀態(tài)下，迂曲度可能發(fā)生改變，如發(fā)育不良皮層區(qū)域的擴(kuò)散由于擴(kuò)散屏障的增加而受影響，導(dǎo)致迂曲度的增加，可能是由于以下幾種原因:皮層層化的消失，細(xì)胞外基質(zhì)分子的蓄積如肌腱蛋白和星形細(xì)胞化過程的增加，已有研究證實(shí)肌腱蛋白R(shí)或肌腱蛋白C缺陷的鼠具有較低的迂曲度［15］。

1.2.3 各向異性擴(kuò)散

迂曲度是一個(gè)張量，具有方向依賴性［24］，迂曲度的方向依賴性導(dǎo)致擴(kuò)散在各個(gè)方向是不一致的，即所謂的各向異性擴(kuò)散，其通常是ECS內(nèi)物質(zhì)和水分子沿一個(gè)方向上的直捷通道運(yùn)動(dòng)(如，沿著胼胝體軸突)并因此可能是某一程度的突觸外傳遞特異性的一個(gè)因素。

白質(zhì)內(nèi)各向異性擴(kuò)散在發(fā)育過程中是增加的:鼠在生后4～9 d，未完全髓鞘化的胼胝體的擴(kuò)散是各向同性的，但是隨著髓鞘化進(jìn)展，擴(kuò)散越來越趨向于各向異性，在生后21～23 d髓鞘阻礙垂直于軸突走行方向的擴(kuò)散，即在橫過神經(jīng)纖維的方向測(cè)量鼠胼胝體的迂曲度，發(fā)現(xiàn)其明顯增加［25］，但是對(duì)于沿著軸突方向的擴(kuò)散只有輕微的影響。也有研究提示鼠從出生至生后12 d胼胝體的擴(kuò)散為各向同性，但是從生后13～17 d各向異性逐漸增加，除了髓鞘化過程，發(fā)生這一變化的另一個(gè)可能原因是鼠腦神經(jīng)膠質(zhì)的產(chǎn)生及伸展［15］。在胼胝體觀察到的這種趨勢(shì)在鼠脊髓也同樣出現(xiàn)，但是不太顯著。ADCw在髓鞘化過程中下降，這種下降在垂直軸突的方向尤為顯著［15］。此外，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞能夠通過產(chǎn)生不同的細(xì)胞外基質(zhì)分子及以其自身的過度生長或增殖形成擴(kuò)散屏障來影響各向異性擴(kuò)散。

1.2.4 非特異性攝取

非特異性攝取k，，在生后腦發(fā)育過程中在不同的皮層和白質(zhì)內(nèi)也均沒有顯著差異，波動(dòng)在3.3×10－3/s到6.3×10－3/s之間，提示未成熟組織的非特異性細(xì)胞攝取與成熟組織相似［18］。已有多項(xiàng)動(dòng)物和人體實(shí)驗(yàn)均表明［26－28］，ISF及其內(nèi)溶質(zhì)存在于毛細(xì)血管和動(dòng)脈壁中膜與外膜之間的血管周圍間隙中，并沿血管周圍間隙從腦內(nèi)引流至頸部淋巴結(jié)［29］。不同腦區(qū)ECS中物質(zhì)的清除途徑和方式也不盡相同，起自尾狀核深部灰質(zhì)的ISF沿各級(jí)動(dòng)脈血管周圍間隙(perivascular space，PVS)，于軟腦膜動(dòng)脈穿越軟腦膜時(shí)，經(jīng)軟腦膜的淋巴孔進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔(subarachnoid sapce，SAS)，隨后一部分隨 CSF通過神經(jīng)周圍的毛細(xì)淋巴管，穿過篩板至鼻粘膜等處的毛細(xì)淋巴管，進(jìn)入頸淋巴結(jié)等顱外淋巴系統(tǒng)［27］;另一部分被SAS絨毛吸收，通過顱內(nèi)靜脈系統(tǒng)［28］進(jìn)入血循環(huán)。而白質(zhì)區(qū)ECS中物質(zhì)的引流則多經(jīng)過擴(kuò)散方式，沿神經(jīng)纖維束流動(dòng)，通過室管膜上皮轉(zhuǎn)運(yùn)入腦室，然后進(jìn)入 SAS［27］。

2 腦ECS在生后發(fā)育過程中發(fā)生變化的影響因素

2.1 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞

膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)組織內(nèi)的功能是多方面的，包括血腦屏障形成、營養(yǎng)支持、發(fā)育功能、細(xì)胞外間隙pH值和離子穩(wěn)態(tài)的控制，以及軸突的電絕緣［3］。星形細(xì)胞在發(fā)育中的作用是指導(dǎo)神經(jīng)元的遷移，影響神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的表型表達(dá)并參與突觸重塑［30］。生后ECS容積分?jǐn)?shù)減小的時(shí)間進(jìn)程與生后離子內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的改變相一致。在生后早期，離子和容量的穩(wěn)態(tài)是易受損的，可能是由于神經(jīng)膠質(zhì)的產(chǎn)生未完成。在未成熟腦自發(fā)性活動(dòng)的某一水平常伴隨著可以導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞嚴(yán)重腫脹的細(xì)胞外離子改變，也與膠質(zhì)增生過程中ECS容積降低相一致［18］。因此，我們可以假設(shè)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和功能上的成熟對(duì)生后發(fā)育過程中ECS容積分?jǐn)?shù)的減小起到很重要的作用。

水通道蛋白4(Aquaporin 4，AQP4)是在腦血管周圍星形細(xì)胞足突高度表達(dá)的水分子選擇通道家族的一員［31］。水通道蛋白參與水穩(wěn)態(tài)及中心血漿滲透壓調(diào)節(jié)，并且有研究證實(shí)AQP4在急性腦損傷后引起腦水腫形成中具有重要作用［32］。AQP4表達(dá)水平在未成熟腦是低的，在出生后隨個(gè)體發(fā)育逐漸增加［33］，而關(guān)于AQP4表達(dá)水平的高低對(duì)擴(kuò)散和迂曲度的影響則尚未有一致的結(jié)果。

Badaut等［34］運(yùn)用MRI方法測(cè)量的表觀擴(kuò)散系數(shù)(apparent diffusion coefficient，ADC)值代表水分子在組織內(nèi)的運(yùn)動(dòng)。水分子擴(kuò)散可以是細(xì)胞外的，細(xì)胞內(nèi)的和跨越細(xì)胞膜的，而ADC值反映這三種成分。有研究證實(shí)病理狀態(tài)下，如低氧缺血和腦積水，ADC值與 AQP4表達(dá)水平直接相關(guān)［35－36］。相繼地，有研究［34］采用RNA干預(yù)敲除AQP4表達(dá)，證實(shí)消除AQP4表達(dá)導(dǎo)致正常腦組織水分子運(yùn)動(dòng)的降低，在MRI上表現(xiàn)為ADC值的降低，由此得知，星形細(xì)胞，特別是他們的水通道，在水分子運(yùn)動(dòng)中起到重要作用。ADC值的降低在神經(jīng)影像中通常被解釋為細(xì)胞毒性水腫的反映，可能是由于AQP4表達(dá)的降低。而 Xiao等［37］運(yùn)用IOI方法發(fā)現(xiàn)AQP4缺失導(dǎo)致容積分?jǐn)?shù)增加，而迂曲度不變，即說明擴(kuò)散系數(shù)是不隨AQP4表達(dá)量的多少而變化的。Yao等［38］也表明離體和在體狀態(tài)下通過小的四甲銨陽離子(MW 74)測(cè)量AQP4缺失的鼠新皮層的迂曲度仍保持不變。但是，Devin K等［39］通過光漂泊方法發(fā)現(xiàn)AQP4缺失的鼠ECS增大，大分子的擴(kuò)散增強(qiáng)。上述方法提出的AQP4表達(dá)降低引起細(xì)胞外間隙擴(kuò)散系數(shù)的變化各不相同，甚至相互矛盾。

2.2 細(xì)胞外基質(zhì)

ECS內(nèi)的溶液不是單一的氯化鈉溶液，其包含大量葡萄糖胺聚糖(如透明質(zhì)酸鹽)、糖蛋白和蛋白聚糖，它們構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)。目前已經(jīng)報(bào)道多種ECS分子和粘附分子，如纖維結(jié)合蛋白，肌腱蛋白，層粘連蛋白等［29］，其含量在發(fā)育、老化、損傷恢復(fù)和許多病理過程中會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。肌腱蛋白R(shí)和肌腱蛋白C缺乏的鼠四甲銨的表觀擴(kuò)散系數(shù)(ADCTMA)和水的表觀擴(kuò)散系數(shù)(ADCw)表現(xiàn)出顯著的變化，提示細(xì)胞外基質(zhì)分子在ECS擴(kuò)散中具有重要作用。肌腱蛋白C主要在神經(jīng)和非神經(jīng)組織發(fā)育的早期階段表達(dá)［40］，相反，肌腱蛋白R(shí)在個(gè)體發(fā)育中表達(dá)較晚，并且其表達(dá)一直持續(xù)到成年。Sykova等［41］對(duì)鼠皮層和海馬的研究均表明肌腱蛋白R(shí)缺失導(dǎo)致α和λ的顯著降低，而研究表明發(fā)育早期階段α值較成年時(shí)大，由此可知幼年時(shí)較大的α值可能受其他因素影響。

ECM分子是由神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的。前面提到迂曲度的兩個(gè)主要影響因素是幾何構(gòu)型和細(xì)胞外基質(zhì)，后者可以減慢各種神經(jīng)活性物質(zhì)在ECS的擴(kuò)散。細(xì)胞外基質(zhì)與擴(kuò)散分子的相互作用通過以下幾種可能機(jī)制:粘性或ECS內(nèi)多聚分子的高密度產(chǎn)生位阻現(xiàn)象，基質(zhì)內(nèi)帶負(fù)電荷的成分與運(yùn)動(dòng)分子陽性成分的靜電相互作用，和特異性結(jié)合(空間吸引)［22］。肌腱蛋白R(shí)或C缺陷的鼠不僅具有較低的迂曲度，而且具有更小的 ECS容積分?jǐn)?shù)［42］。上述發(fā)現(xiàn)可以提示這些分子對(duì)于保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)分離，如保持ECS在其最佳大小是很重要的。

透明質(zhì)酸酶和軟骨素硫酸鹽蛋白聚糖是ECM的必要成分，形成海馬和皮層內(nèi)圍繞神經(jīng)元的神經(jīng)元周圍網(wǎng)絡(luò)(perineuronal net，PN)。發(fā)育過程中PN形成圍繞在細(xì)胞體和中間神經(jīng)元鄰近樹突突觸的晶格狀結(jié)構(gòu)，并影響突觸發(fā)育和穩(wěn)定性。雖然PN的確切功能尚不清楚，但是其很有可能與維持現(xiàn)有突觸的穩(wěn)定性、阻止成熟神經(jīng)元的新突觸形成以及維持ECM與細(xì)胞骨架的連接有關(guān)，并可能影響神經(jīng)元-星形細(xì)胞的相互作用［43］，PN在中間神經(jīng)元的突觸周圍定位可能提示其在維持突觸穩(wěn)定性中的作用。

發(fā)育過程中，細(xì)胞外環(huán)境是可溶的，一部分原因是透明質(zhì)酸表達(dá)量較高，透明質(zhì)酸可以與水相互作用并組織協(xié)調(diào)水的分布，為軸突移行和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性提供了較大的含水空間。在成年，透明質(zhì)酸表達(dá)水平較低，并且可溶性更低。這些相互作用形成細(xì)胞外間隙的不溶性系統(tǒng)。這些不溶性系統(tǒng)似乎也在成熟神經(jīng)系統(tǒng)可塑性和運(yùn)動(dòng)性的降低中起到重要作用。

綜上可知，ECM在CNS的發(fā)育中起重要作用，通過協(xié)調(diào)組織這一空間，使間隙內(nèi)其他分子和細(xì)胞處于最佳狀態(tài)。ECM有助于神經(jīng)元功能的多樣性，包括增殖、移行、形態(tài)分化、突觸形成、突觸穩(wěn)定性和細(xì)胞信號(hào)級(jí)聯(lián)［44］。

3 腦ECS在發(fā)育中的意義

ECS起信息通道作用的觀點(diǎn)受到越來越多人的支持。發(fā)育中鼠腦內(nèi)相對(duì)較大的ECS空間可能影響ECS內(nèi)離子和神經(jīng)活性物質(zhì)的聚集和代謝。當(dāng)ECS容積分?jǐn)?shù)減小的時(shí)候，任何存在于或釋放到ECS的物質(zhì)濃度則相應(yīng)的增加。

發(fā)育中相對(duì)較大的ECS容積分?jǐn)?shù)會(huì)對(duì)由細(xì)胞釋放的物質(zhì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的稀釋作用，這對(duì)機(jī)體來說是一種保護(hù)性機(jī)制。在一些病理事件如缺氧、痙攣或擴(kuò)散性抑制過程中出現(xiàn)的較大的活性相關(guān)的離子可能會(huì)減少，并且興奮性氨基酸、抑制性遞質(zhì)以及與那些病理狀態(tài)有關(guān)的代謝物質(zhì)會(huì)過度聚集。未成熟腦對(duì)于低氧、缺血和癲癇的相對(duì)敏感性比成年腦小［45］，如在未成熟的海馬，較大的細(xì)胞外間隙代表未成熟組織對(duì)于興奮性刺激具有更強(qiáng)的抵抗性。

我們已經(jīng)知道未成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)與成熟的不同，因?yàn)槠溲芑赐瓿桑⑶疑窠?jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(其被假定為溶質(zhì)和小分子的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)移路徑)發(fā)育不完全，外部的神經(jīng)膠質(zhì)限制性膜也還沒有完全建立。鼠大腦皮層內(nèi)血管的生長在生后第一個(gè)10 d內(nèi)同時(shí)出現(xiàn)。鼠在生后第一個(gè)10 d，ECS較大但是開放的血管很少，但是，在生后第二個(gè)10 d，大多數(shù)血管出現(xiàn)開放的管腔以及由星形細(xì)胞終足形成的血管周圍鞘，且ECS變?。?0］。因此，ECS的大小與血管化的程度可能存在反相關(guān)，而且ECS可能在血管貫穿入腦之前為代謝產(chǎn)物運(yùn)輸提供主要的路徑。從另一方面，擴(kuò)散可能對(duì)傳遞可溶性物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞有效，并且擴(kuò)散可能是神經(jīng)元、樹突、膠質(zhì)細(xì)胞廣泛生長之前的有效的傳遞形式，且先于血管化的發(fā)育［18］。

發(fā)育過程的其它一些方面(如遷移過程的調(diào)控)也有可能依賴于ECS內(nèi)擴(kuò)散梯度的存在。多肽、激素和生長因子，以及不易透過細(xì)胞膜的藥物的擴(kuò)散在更大的ECS內(nèi)會(huì)更加容易，但是在較小的ECS內(nèi)擴(kuò)散會(huì)減慢。

4 總結(jié)與展望

腦細(xì)胞外間隙是神經(jīng)元生存的微環(huán)境，其正常功能對(duì)維持細(xì)胞間電信號(hào)傳導(dǎo)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和神經(jīng)突觸重塑等都具有重要意義，在生后腦發(fā)育過程中，ECS的解剖結(jié)構(gòu)及生理性能均發(fā)生變化，這一變化與多種因素有關(guān)。但是目前為止神經(jīng)科學(xué)的主要進(jìn)展基本都是基于1930年代西班牙卡哈爾的神經(jīng)元學(xué)說，而對(duì)于神經(jīng)元所生存的微環(huán)境一直以來都是關(guān)注的盲區(qū)［46］。以往對(duì)于 ECS的研究比較零散，結(jié)果有時(shí)互相矛盾，一個(gè)原因是其只能局部測(cè)量，缺少整體的宏觀的解剖生理學(xué)結(jié)果支持，另一個(gè)問題是關(guān)于研究方法的模型選擇與簡化，參數(shù)擬合中一個(gè)尚未解決的問題是腦ECS與擴(kuò)散分子之間電荷的相互作用，該項(xiàng)在擴(kuò)散方程中的存在仍無定論。近年來，由 Han H［47］等人提出的 Gd-DTPA介導(dǎo)的磁共振示蹤成像法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)全腦的實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)和可視化的定量研究，目前已完成成年鼠全腦11個(gè)腦區(qū)的組織通道生理特性的研究，對(duì)于發(fā)育中鼠腦的研究也正在進(jìn)行。

腦發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的過程，其中的變異是許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基礎(chǔ)，美國的“通過推動(dòng)創(chuàng)新型神經(jīng)技術(shù)開展大腦研究”計(jì)劃也將腦發(fā)育放在重要位置。腦細(xì)胞外間隙研究在腦發(fā)育中的應(yīng)用是認(rèn)識(shí)發(fā)育中神經(jīng)活動(dòng)規(guī)律及腦病發(fā)生發(fā)展機(jī)制的重要課題。此外，腦細(xì)胞外間隙在腦病治療和認(rèn)知科學(xué)發(fā)展中具有廣闊的研究前景和學(xué)術(shù)價(jià)值，腦科學(xué)研究也將進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞與神經(jīng)細(xì)胞生存的微環(huán)境并行發(fā)展的新時(shí)代。

［1］ 王國卿，封麗芳，夏作理．腦內(nèi)物質(zhì)的淋巴引流與腦細(xì)胞微環(huán)境［J］．中國微循環(huán)，2005，9(3):215 －218．

［2］ 田牛，李玉珍，劉鳳英．腦微循環(huán)的特點(diǎn)［J］．微循環(huán)學(xué)雜志，1999，9(3):40 －44．

［3］ Sykova E，Nicholson C．Diffusion in brain extracellular space［J］．Physiol Rev，2008，88(4):1277 －1340．

［4］ Kilb W，Dierkes PW，Sykova E，et al．Hypoosmolar conditions reduce extracellular volume fraction and enhance epileptiform activity in the CA3 region of the immature rat hippocampus［J］．J Neurosci Res．2006，84(1):119 －129．

［5］ Wolak DJ，Pizzo ME，Thorne RG．Probing the extracellular diffusion of antibodies in brain using in vivo integrative optical imaging and ex vivo fluorescence imaging［J］．J Control Release．2015，10;197:78 －86．

［6］ Thorne RG，Hrabetova S，Nicholson C．Diffusion of epidermal growth factor in rat brain extracellular space measured by integrative optical imaging［J］．J Neurophysiol，2004，92(6):3471－3481．

［7］ Birngruber T，Ghosh A，Perez-Yarza V，et al．Cerebral open flow microperfusion:a new in vivo technique for continuous measurement of substance transport across the intact blood-brain barrier［J］．Clin Exp Pharmacol Physiol．2013，40(12):864－871．

［8］ Syková E，Mazel T，Simonová Z．Diffusion constraints and neuron-glia interaction during aging［J］．Exp Gerontol．1998，33(7－8):837－851．

［9］ Thorne RG，Nicholson C．In vivo diffusion analysis with quantum dots and dextrans predicts the width of brain extracellular space［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2006，103(14):5567 －5572．

［10］ Carare RO，Bernardes-Silva M，Newman TA，et al．Solutes，but not cells，drain from the brain parenchyma along basement membranes of capillaries and arteries:significance for cerebral amyloid angiopathy and neuroimmunology［J］．Neuropathol Appl Neurobiol，2008，34(2):131 －144．

［11］ Han H，Li K，Yan J，et al．An in vivo study with an MRI tracer method reveals the biophysical properties of interstitial fluid in the rat brain［J］．Sci China Life Sci，2012，55(9):782 － 787．

［12］ Xu F，Han H，Zhang H，et al．Quantification of Gd-DTPA concentration inneuroimaging using T(1)3D MP-RAGE sequence at 3.0 T［J］．Magn Reson Imaging，2011，29(6):827－834．

［13］ Han H，Xia Z，Chen H，et al．Simple diffusion delivery via brain interstitial route for the treatment of cerebral ischemia［J］．Sci China Life Sci，2011，54(3):235 －239．

［14］ Nicholson C，Sykova E．Extracellular space structure revealed by diffusion analysis［J］．Trends Neurosci，1998，21(5):207－215．

［15］ Vargova L， Sykova E． Extracellularspace diffusion and extrasynaptic transmission［J］．Physiol Res，2008，57 Suppl 3:S89－S99．

［16］ Bondareff W，Pysh JJ．Distribution of the extracellular space during postnatal maturation of rat cerebral cortex［J］．Anat Rec，1968，160(4):773 －780．

［17］ Pysh JJ．The development of the extracellular space in neonatal rat inferior colliculus:an electron microscopic study［J］．Am J Anat，1969，124(4):411 －429．

［18］ Lehmenkuhler A，Sykova E，Svoboda J，et al．Extracellular space parameters in the rat neocortex and subcortical white matter during postnatal development determined by diffusion analysis［J］．Neuroscience，1993，55(2):339 －351．

［19］ Sizonenko SV，Camm EJ，Garbow JR，et al．Developmental changes and injury induced disruption of the radial organization of the cortex in the immature rat brain revealed by in vivo diffusion tensor MRI［J］．Cereb Cortex，2007，17(11):2609 －2617．

［20］ Edgar LT，Underwood CJ，Guilkey JE，et al．Extracellular matrix density regulates the rate ofneovesselgrowth and branching in sprouting angiogenesis［J］．PLoS One．2014，22;9(1):e85178．

［21］ Riol H，F(xiàn)ages C，Tardy M．Transcriptional regulation of glial fibrillary acidicprotein(GFAP)-mRNA expressionduring postnatal development of mouse brain［J］．J Neurosci Res，1992，32(1):79 －85．

［22］ Nicholson C，Kamali-Zare P，Tao L．Brain Extracellular Space as a Diffusion Barrier［J］．Comput Vis Sci，2011，14(7):309 －325．

［23］ Thorne RG，Nicholson C．In vivo diffusion analysis with quantum dots and dextrans predicts the width of brain extracellular space［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103(14):5567 －5572．

［24］ Vorisek I，Sykova E．Measuring diffusion parameters in the brain:comparing the real-time iontophoretic method and diffusion-weighted magnetic resonance［J］．Acta Physiol(Oxf)，2009，195(1):101 －110．

［25］ Vorisek I，Sykova E．Evolution of anisotropic diffusion in the developing rat corpus callosum［J］．J Neurophysiol，1997，78(2):912－919．

［26］ Polfliet MM，Zwijnenburg PJ，van Furth AM，et al．Meningeal and perivascular macrophages of the central nervous system play a protective role during bacterial meningitis［J］．J Immunol，2001，167(8):4644 －4650．

［27］ Clapham R，O＇Sullivan E，Weller RO，et al．Cervical lymph nodes are found in direct relationship with the internal carotid artery:significance for the lymphatic drainage of the brain［J］．Clin Anat．2010，23(1):43 －47．

［28］ Dickstein JB， Moldofsky H， Lue FA， et al．Intracerebroventricular injection of TNF-alpha promotes sleep and is recovered in cervical lymph［J］．Am J Physiol，1999，276(4 Pt 2):R1018－R1022．

［29］ Kida S，Steart PV，Zhang ET，et al．Perivascular cells act as scavengers in the cerebral perivascular spaces and remain distinct from pericytes， microglia and macrophages［J］． Acta Neuropathol，1993，85(6):646 －652．

［30］ Macaulay N，Zeuthen T．Glial K(+)clearance and cell swelling:key roles for cotransporters and pumps［J］．Neurochem Res，2012，37(11):2299 －2309．

［31］ Venero JL，Burguillos MA，Brundin P，et al．The executioners sing a new song:killer caspases activate microglia［J］．Cell Death Differ，2011，18(11):1679 －1691．

［32］ Tait MJ，Saadoun S，Bell BA，et al．Water movements in the brain:role of aquaporins［J］．Trends Neurosci，2008，31(1):37－43．

［33］ Nico B，F(xiàn)rigeri A，Nicchia GP，et al．Role of aquaporin-4 water channel in the development and integrity of the blood-brain barrier［J］．J Cell Sci，2001，114(Pt 7):1297 － 1307．

［34］ Badaut J，Ashwal S，Adami A，et al．Brain water mobility decreases after astrocytic aquaporin-4 inhibition using RNA interference［J］．J Cereb Blood Flow Metab，2011，31(3):819－831．

［35］ Meng S，Qiao M，Lin L，et al．Correspondence of AQP4 expression and hypoxic-ischaemic brain oedema monitored by magnetic resonance imaging in the immature and juvenile rat［J］．Eur J Neurosci，2004，19(8):2261 －2269．

［36］ Tourdias T，Brochet B，Petry KG，et al．［Magnetic resonance imaging of central nervous system inflammation］［J］．Rev Neurol(Paris)，2009，165 Suppl 3:S77 －S87．

［37］ Xiao F，Hrabetova S．Enlarged extracellular space of aquaporin-4-deficient mice does not enhance diffusion of Alexa Fluor 488 or dextran polymers［J］．Neuroscience，2009，161(1):39 －45．

［38］ Yao X，Hrabetova S，Nicholson C，et al．Aquaporin-4-deficient mice have increased extracellular space without tortuosity change［J］．J Neurosci，2008，28(21):5460 －5464．

［39］ Binder DK，Papadopoulos M C，Haggie P M，et al．In vivo measurement of brain extracellular space diffusion by cortical surface photobleaching［J］．J Neurosci，2004，24(37):8049－8056．

［40］ Jones PL，Jones FS．Tenascin-C in development and disease:gene regulation and cell function［J］．Matrix Biol，2000，19(7):581－596．

［41］ Sykova E，Vorisek I，Mazel T，et al．Reduced extracellular space in the brain of tenascin-R-and HNK-1-sulphotransferase deficient mice［J］．Eur J Neurosci，2005，22(8):1873 －1880．

［42］ Evers MR，Salmen B，Bukalo O，et al．Impairment of L-type Ca2 + channel-dependentforms ofhippocampalsynaptic plasticity in mice deficient in the extracellular matrix glycoprotein tenascin-C［J］．J Neurosci，2002，22(16):7177 －7194．

［43］ Mcrae PA，Baranov E，Sarode S，et al．Aggrecan expression，a component of the inhibitory interneuron perineuronal net，is altered following an early-life seizure［J］．Neurobiol Dis，2010，39(3):439－448．

［44］ Kwok JC，Dick G，Wang D，et al．Extracellular matrix and perineuronal nets in CNS repair［J］．Dev Neurobiol，2011，71(11):1073－1089．

［45］ Kilb W，Dierkes PW，Sykova E，et al．Hypoosmolar conditions reduce extracellular volume fraction and enhance epileptiform activity in the CA3 region of the immature rat hippocampus［J］．J Neurosci Res，2006，84(1):119 －129．

［46］ 韓鴻賓．神經(jīng)元學(xué)說的補(bǔ)丁—腦細(xì)胞生存的微環(huán)境［J］．科技導(dǎo)報(bào)，2012(26):71－74．

［47］ Han H，Li K，Yan J，et al．An in vivo study with an MRI tracer method reveals the biophysical properties of interstitial fluid in the rat brain［J］．Sci China Life Sci，2012，55(9):782 － 787．