腸道病毒71型3D蛋白研究進展

喬 喬，王志玉，溫紅玲

腸道病毒71型3D蛋白研究進展

喬 喬，王志玉，溫紅玲

目的 EV71感染可引起嬰幼兒手足口病，甚至導致死亡。近年來由EV71引發的手足口病一直呈上升的流行趨勢。目前中國對于手足口病的疫苗研究已進入臨床試驗階段，但EV71引起的重癥手足口病的發病機制仍不明確。3D蛋白主要負責病毒的復制過程，是抗病毒藥物的靶點之一。本文就EV71的3D蛋白的結構功能及針對其作為靶點的抗病毒藥物作一綜述。

EV71；3D蛋白；抗病毒藥物

腸道病毒71型和柯薩奇病毒A16都可引起嬰幼兒手足口病，但EV71引起的手足口病可導致嚴重的中樞神經系統并發癥，包括無菌性腦膜炎，腦干炎，小腦炎和腦脊髓炎等，有較高的致殘率和病死率[1]。1969年美國加利福尼亞首次分離出EV71后，在世界范圍內呈周期性暴發或流行，主要發生在亞太地區，在中國大陸及臺灣地區均有報道[2-4]，EV71感染引起的手足口病對公眾健康已構成了嚴重威脅。我國衛生部已于2008年5月將手足口病列入丙類傳染病，所以如何防治EV71等病毒引起的手足口病已成為一個嚴峻的問題。

1 EV71的蛋白結構和基因結構

人類腸道病毒71型屬于小核糖核酸病毒科，腸道病毒屬A組，無包膜，由60個原體構成的直徑約30 nm的正二十面體，每個原體都由VP1，VP2，VP3和VP4 4種結構蛋白構成[5]，其中VP1，VP2，VP3在病毒外側，VP4在病毒內側。VP1是病毒進入細胞的關鍵，且包含多個抗原決定簇。病毒殼內是一條單股正鏈RNA，約有7 500個核苷酸。RNA上僅有1個開放閱讀框架(ORF)，編碼1個含有2 193個氨基酸的多聚(蛋白，該多聚蛋白可進一步水解為P1、P2、P3 3個前體蛋白，并被自身產生的2C蛋白酶和3C蛋白酶切割成11個結構蛋白和非結構蛋白，其中P1基因編碼VP1、VP2、VP3、VP4 4個結構蛋白，P2、P3基因分別編碼2A、2B、2C和3A、3B、3C、3D 7個非結構蛋白[5]。ORF兩側為5(和3(非編碼區(UTRs)，在3(UTRs有多聚腺苷酸(polyA)尾，在5(UTRs共價結合一個小分子量蛋白VPg(3B)。

2 3Dpol的一級結構與晶體結構

在小核糖核酸病毒中，脊髓灰質炎病毒(PV)的3Dpol的晶體結構于2004年首個被解析出，腸道病毒71型的3D蛋白結構也于2010年也被解析出，分辨率為2.4。以FMDV為例，其3D蛋白晶體結構像人的右手手掌，有3個結構域，分別為“手掌”，“拇指”和“手指”，手指結構域和拇指結構域通過N-端結構域相連[5]。除此之外，在3D蛋白分子的背面有一條帶正電荷的渠道，這個帶正電荷的結構可利于打開與之結合的RNA的2級結構[6]，且這些帶正電荷的氨基酸可與NTPs相互作用，并形成一個保守區域(motif F)。“手掌”結構域核心為3個反平行的β折疊，外圍是3個α螺旋，這個結構是已知的核苷酸聚合酶結構中高度保守的[6]。所有小核糖核酸病毒的3D聚合酶的“手掌”結構域都具有催化位點。除了基序F以外，3Dpol仍有5個保守區域，分別為Motif A、B、C、D、E。其中，Motif A與B負責核苷酸的識別與結合，Motif A與C負責磷酸基團的轉移，Motif C上含有體現RdRp功能特征的保守序列GDD[7]，Motif D維持手掌結構域的完整，Motif E是結合引物的區域。 “手掌”、“手指”、“拇指”3個結構域構成閉合的右手狀，其中食指、環指、小指形成與單鏈模板RNA結合的孔道并向位于手掌結構域的活性位點延伸，而引物與拇指結構域相作用。EV71的3D聚合酶在Mn2+存在條件下有活性，在Co2+存在時幾乎沒有活性，在Mg2+、Ca2+、Cu2+、Ni2+、Cd2+或Zn2+存在時完全沒有活性。體外轉錄活性研究表明，EV71 3D可以利用雙核苷酸和十核苷酸 RNA 作為引物，以 poly(C)和基因組 RNA 為模板從頭起始轉錄，DNA引物如寡聚dT15可以增強其轉錄活性[8]。

3 3Dpol與病毒復制

3D聚合酶是RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)。RNA復制的起始過程主要分為兩種：非引物依賴型(de novo)和引物依賴型[9]。非引物依賴型的起始過程至少需要以下4種物質：(1)RNA依賴的RNA聚合酶；(2)具有病毒特異性起始核苷酸的RNA模板；(3)起始三磷酸核苷；(4)NTPs。首先是在起始三磷酸核苷和NTPs之間形成磷酸二酯鍵。起始核苷酸為下一個核苷酸提供3′-OH。De novo的優點在于復制過程中沒有遺傳物質的丟失，不需要額外的酶去合成引物以及斷開RNA模板鏈和新合成的RNA鏈之間的區域。大多數情況下，de novo起始過程結束后就是延伸，但有的時候de novo過程會生成無效的RNA產物或是之后作為引物的短的RNA寡核苷酸[10]。引物依賴型的起始過程需要一個寡核苷酸或者是蛋白質作為引物：(1)從mRNA的5(UTRs帽子結構切下來的寡核苷酸作為引物；(2)RdRp在RNA合成過程中中斷形成的RNA小片段作為引物；(3)模板RNA的3(UTRs折返回來作為引物；(4)蛋白質作為引物是由氨基酸提供羥基。小核糖核酸病毒都是以VPg這個蛋白質作為引物開始RNA的復制過程[6]。VPg被3D聚合酶尿苷酸化是RNA復制的起始，對于VPg介導的FMDV的RNA復制起始機制研究的已經很清楚[11]。小核糖核酸的復制起始于兩個UMP分子連續吸附在VPg的Try3的羥基上，然后3D通過一種滑回機制使用一個內部的染色體組的莖環結構作為模板來催化VPg成為引物。FMDV的3D和尿苷酸化以及未尿苷酸化的VPg形成的復合物都顯示VPg占據在3D聚合酶中間的渠道中。Try3的羥基作為核苷酸引物的3′端自由羥基的分子類似物被放置在核苷的活性位點，從而啟動了復制過程。EV71的復制過程還不甚明了，但同作為小核糖核酸病毒科，EV71與FMDV的復制起始機制相差不多。有研究發現[12]，EV71的3D聚合酶的拇指結構域上的Site-311是VPg連接的位點，且EV71的VPg尿苷酸化是一個3Dpol的雙分子機制，也就是一個3Dpol分子提供VPg的Try3的羥基連接到另一個3Dpol分子的聚合酶活性位點，這種方式輪流催化了VPg→VPg-pU的轉換。對Site-311進行突變可減少VPg的尿苷酸化，這對于EV71的復制是致命的，所以預測Site-311是一個潛在的抗病毒靶點。3D聚合酶上的“手掌”、“手指”和“拇指”三個結構域的保守區域都對穩定VPg起到了重要作用。Motif F帶正電的核苷酸也參與尿苷酸化的過程，保證了VPg和UMP在催化反應中的正確構象。兩個二價陽離子和Motif A和C的天冬氨酸殘基一起催化尿苷酸化反應。RNA延伸過程是基于有序的核苷酸添加反應，這個反應是引物鏈3′UTRs羥基對核苷三磷酸的α磷酸基進行親核攻擊，這導致了磷酸二酯鍵的形成和焦磷酸(PPi)的釋放。根據兩個金屬模型催化作用，一個金屬會降低引物3′UTRs羥基的pKa值，使得其去質子化，另一個金屬會正確引導三磷酸進入核酸的方向。據此得出假設，PPi是在釋放之前被質子化的。有研究結合不同聚合酶模型的誘變分析和核酸動力學得出：聚合酶的活性位點上的帶正電的氨基酸為PPi的質子化提供質子[13]。因此，3D聚合酶催化VPg的尿苷酸化是RNA復制的起始，且聚合酶活性位點為PPi的質子化提供質子導致PPi的釋放，從而促進了RNA的延伸。

4 3Dpol作為抗病毒藥物靶點

3Dpol是以RNA為復制模板的RNA聚合酶，目前還沒有針對3Dpol的特異藥物，但是由于3Dpol是EV71復制的關鍵，所以設計針對3Dpol靶點的藥物對于抑制EV71的復制很重要。現在使用的對抗小核糖核酸病毒的藥物多為廣譜抗病毒藥，如核苷類似物：Ribavirin和2(-C-methylcystidine[14-17]，還有非核苷類似物，如DTriP-22，它是一種包含哌嗪的吡唑嘧啶衍生物。有的研究表明，包含哌嗪的吡唑嘧啶衍生物對抗EV71有效，且吡唑嘧啶上包含一個苯基，哌嗪包含一個疏水的二芳基甲基對于抗病毒作用意義更大。DTriP-22與其他的衍生物相比其抗EV71活性的效果更好[19]，因此被選為抗EV71藥物。DTriP-22的抗EV71活性已通過不同的病毒滴度進行評估，在RD細胞中病毒感染復數(MOI)分別為0.001、0.1和1PFU/cell時，DTriP-22都具有抑制EV71的能力。在MOI為0.001 PFU/cell和1 PFU/cell時其EC50分別為0.023和0.16 μmol·L-1[18]。DTriP-22作用于3D聚合酶的位點是R163K，比較分析腸道病毒屬136株病毒，發現此區域很保守，晶體結構表明Arg-163位于“右手”結構的“環指”結構域，此結構域包含有Arg-163、Lys-167和Arg-174這幾個堿性氨基酸殘基，這些堿性氨基酸殘基與RNA復制中即將參與的核苷三磷酸相互作用，DTriP-22通過阻止核苷酸進入3D聚合酶的空穴結構而抑制RNA鏈的延伸[19-20]。Huang等研究表明金黃三羧酸(ATA)通過抑制3D聚合酶的延伸活性從而抑制EV71的復制，其抑制EV71的細胞病變效應(CPE)的EC50是2.9 μmol·L-1，CC50大于211 μmol·L-1[21]。DTriP-22與ATA是抗EV71機制很明確的藥物，除此之外，Chern[18]等合成了化合物pyrazolo [3,4-d]pyrimidines，具有抗EV71的作用，其EC50為0.32～65 μmol·L-1，CC50大于 25 μmol·L-1。還有研究[22]表明從植物中提取的raoulic acid也具有抗病毒作用。其EC50小于0.1 μg·mL-1。

5 小 結

EV71的3D聚合酶主要參與病毒的復制過程，其機制尚不明確，尤其是RNA與宿主細胞蛋白的相互作用仍不清楚。

抗EV71 3D聚合酶的藥物已有研究，但尚未有理想的抗病毒藥物。目前仍需深入研究潛在的抗病毒靶點，研制新藥。其次，要將設計活性高、毒性低的抗病毒藥物與對現存藥物的修飾相結合研制出有效的抗EV71藥物并發展有臨床效果的中藥。然后，將作用于病毒復制不同過程和不同靶點的藥物進行復合治療，有望得到良好效果。

[1]McMinn PC. An overview of the evolution of enterovirus 71 and its clinical and public health significance[J]. FEMS Microbiol Rev, 2002, 26(1): 91-107.

[2]Mao LX, Wu B, Bao WX, et al. Epidemiology of hand, foot, and mouth disease and genotype characterization of Enterovirus 71 in Jiangsu, China[J]. J Clin Virol, 2010, 49(2): 100-104.

[3]Chen KT, Chang HL, Wang ST, et al. Epidemiologic features of hand-foot-mouth disease and herpangina caused by enterovirus 71 in Taiwan, 1998 2005[J]. Pediatrics, 2007, 120(2): e244-e252.

[4]Zhang Y, Tan XJ, Wang HY, et al. An outbreak of hand, foot, and mouth disease associated with subgenotype C4 of human enterovirus 71 in Shandong, China[J]. J Clin Virol, 2009, 44(4): 262-267.

[5]Ferrer-Orta C, Arias A, Escarmis C, et al. A comparison of viral RNA-dependent RNA polymerases[J]. Curr Opin Structural Biol, 2006, 16(1): 27-34.

[6]Bruenn JA. A structural and primary sequence comparison of the viral RNA-dependent RNA polymerases[J]. Nucleic Acids Res, 2003, 31(7): 1821-1829.

[7]Wu Y, Lou Z, Miao Y, et al. Structures of EV71 RNA-dependent RNA polymerase in complex with substrate and analogue provide a drug target against the hand-foot-and-mouth disease pandemic in China[J]. Protein Cell, 2010, 1(5): 491-500.

[8]Jiang H, Weng L, Zhang N, et al. Biochemical characterization of enterovirus 71 3D RNA polymerase[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms, 2011, 1809(3): 211-219.

[9]van Dijk AA, Makeyev EV, Bamford DH. Initiation of viral RNA-dependent RNA polymerization[J]. J General Virol, 2004, 85(5): 1077-1093.

[10]Kao CC, Singh P, Ecker DJ. De novo initiation of viral RNA-dependent RNA synthesis[J]. Virology, 2001, 287(2): 251-260.

[11]Ferrer-Orta C, Agudo R, Domingo E, et al. Structural insights into replication initiation and elongation processes by the FMDV RNA-dependent RNA polymerase[J]. Curr Opin Structural Biol, 2009, 19(6): 752-758.

[12]Sun Y, Wang Y, Shan C, et al. Enterovirus 71 VPg uridylation uses a two-molecular mechanism of 3D polymerase[J]. J Virol, 2012, 86(24): 13662-13671.

[13]Castro C, Smidansky ED, Arnold JJ, et al: Nucleic acid polymerase use a general acid for nucleotidyl transfer[J]. Nat Struct Mol Biol 2009, 16: 212-218.

[14]Goris N, De Palma A, Toussaint JF, et al. 2′-C-Methylcytidine as a potent and selective inhibitor of the replication of foot-and-mouth disease virus[J]. Antiviral Res, 2007, 73(3): 161-168.

[15]Harki DA, Graci JD, Galarraga JE, et al. Synthesis and antiviral activity of 5-substituted cytidine analogues: identification of a potent inhibitor of viral RNA-dependent RNA polymerases[J]. J Medic Chem, 2006, 49(21): 6166-6169.

[16]Kishimoto C, Crumpacker C/S, Abelmann WH. Ribavirin treatment of murine coxsackievirus B3 myocarditis with analyses of lymphocyte subsets[J]. J Am Coll Cardiol, 1988, 12(5): 1334-1341.

[17]Graci JD, Too K, Smidansky ED, et al. Lethal mutagenesis of picornaviruses with N-6-modified purine nucleoside analogues[J]. Antimicrobial Agents Chemother, 2008, 52(3): 971-979.

[18]Chern JH, Shia KS, Hsu TA, et al. Design, synthesis, and structure activity relationships of pyrazolo [3, 4-d]pyrimidines: a novel class of potent enterovirus inhibitors[J]. Bioorganic Medic Chem Lett, 2004, 14(10): 2519-2525.

[19]Chen TC, Chang HY, Lin PF, et al. Novel antiviral agent DTriP-22 targets RNA-dependent RNA polymerase of enterovirus 71[J]. Antimicrobial Agents and Chemother, 2009, 53(7): 2740-2747.

[20]Kuo RL, Shih SR. Strategies to develop antivirals against enterovirus 71[J]. Virol J, 2013, 10(1): 28.

[21]Hung HC, Chen TC, Fang MY, et al. Inhibition of enterovirus 71 replication and the viral 3D polymerase by aurintricarboxylic acid[J]. J Antimicrobial Chemother, 2010, 65(4): 676-683.

[22]Choi HJ, Lim CH, Song JH, et al. Antiviral activity of raoulic acid fromRaouliaaustralisagainst Picornaviruses[J]. Phytomedicine, 2009, 16(1): 35-39.

Wen Hong-ling, Email: wenhongling@sdu.edu.cn

Advances research in 3D protein of Enterovirus 71

QIAO Qiao,WANG Zhi-yu,WEN Hong-ling

(DepartmentofVirology,SchoolofPublicHealth,ShandongUniversity,Jinan250012,China)

EV71 infection can cause infant hand, foot and mouth disease, and even lead to death. In recent years, the hand, foot and mouth disease caused by EV71 has been on the rise trend. The research in vaccine of hand, foot and mouth disease has entered the stage of clinical trials at present in China, but the pathogenesis mechanism of EV71 is still not fully understood. The 3D protein that is mainly responsible for viral replication process is one of the targets of anti-viral drugs. This paper makes a review about the structure and function of the 3D protein of EV71 and aimed at it as a target of antiviral drugs.

EV71; 3D protein; anti-viral drugs

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.08.016

國家自然科學基金(No.81371833)；山東省醫藥衛生科技發展計劃(No.2013WS0211)聯合資助

溫紅玲，Email: wenhongling@sdu.edu.cn

山東大學公共衛生學院病毒學研究室，實驗畸形學教育部重點實驗室，濟南 250012；

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81371833) and the Medical and Health Science and Technology Development project(No. 2013WS0211)

R373

A

1002-2694(2015)08-0763-03

2014-10-09；

2015-01-21