精子分離技術及在牛性別控制中的應用

李春明 （內蒙古錫林浩特市錫盟畜牧工作站 026000）

精子分離技術及在牛性別控制中的應用

李春明 （內蒙古錫林浩特市錫盟畜牧工作站 026000）

自人類馴化動物開始，人們就有控制動物后裔性別的愿望。無數的民間偏方被流傳數千年，而首次成功只是大約30年前的事情，即從牛附植前胚胎組織采集細胞做核型分析，鑒定性別。近10年隨著應用PCR技術的特效方法的發展，使快速和準確鑒定胚胎性別成為可能。但是，采取胚胎性別鑒定的路線要丟棄不希望性別的胚胎。另外，它還需要實施胚胎移植操作。然而，受精前的精子性別分離可克服這些不足。由于X精于和Y精子客觀存在的物理、化學和免疫上的差異，引起許多研究者嘗試去分離它們，但直到高分辨率的精子分揀技術問世前，并未取得明顯進展。因而，精子性別分離技術的最新成果，提供了一個準確、高效和較少浪費的后裔性別先決的方法。

1 公牛精子流動分揀技術

依據DNA含量不同的精子流動分揀技術預選牛的性別，提供了一個預先決定犢牛性別的方法，其準確率為85～95%。這項性別分離技術采用細胞分揀儀，其工作原理是依據精子的DNA含量分離精子。帶X染色體的精子，所含DNA比帶Y染色體的精子約多4%。DNA含量的測定是用一種結合DNA的特異染料二苯并咪唑對采集的鮮精做活體染色。在精子與這種染料共培養1h后，當被染色的精子暴露在短波長光的激光束下時，發出明亮的藍色熒光。被二苯并咪唑著色的X精子比Y精子發出較強的熒光，因為它的DNA含量較高。被染色的X精子和Y精子發出的熒光信號能被光電倍增管準確地檢測到。當排成一列縱隊而行的精子通過光電倍增管前時，它們發出的熒光信號被定量檢測和經過計算機處理，可使大部分精子 （不是所有的）的DNA含量得到準確測量。只有位于適宜的方向時，精子的DNA含量才能被儀器準確測量，并且這個測定只是在含有精子的液流流出分揀儀的噴口時才發生。噴口自身以非常高的頻率震動，以約l/90000s的速率形成一個微滴。這些含有精子的微滴具正電荷或負電荷，依檢測儀得到的DNA含量信息而異。在沒有精子時、多于一個精子或精子的DNA含量不能被準確地檢測時，微滴不具電荷。死精子用另一種不透過膜的染料染色，從活的精子中分離出來，作為廢物棄掉。這個用于精子性別分離的流動細胞分揀系統就是著名的SX MoFlo。具正電荷或負電荷的含有精子的微滴被沖有與精子相反電荷的黃銅板吸引而發生偏轉。

這些含有X精子或Y精子、沒有精子或多于一個精子的液滴流經噴口，被收集于3個不同的容器中。這項分揀技術能使性別分離和收集的精子達40%，精子約以100km/h的速度通過分揀儀，處理精子的速率為20000個/s（以總精子數計）。這樣，每秒可同時分揀4000個兩性別的精子，因而能以每小時 （10-13）×106的速率生產各性別活精子，準確率達 85～95%。

經分離的精子，按授精劑量 （通常少于未經篩選分離的精液）包裝，再用于人工授精。從Seidel（1999）的試驗來看，這種分離技術分離出的精子人工授精所獲得的懷孕率（懷孕率稍低，但無統計上的差異）、出生率及隨后的生長發育與對照組獲得的相似。

2 分離精子在畜牧上的應用

英國的Cogent公司是世界上第一家利用分離精子技術投入生產的公司。2000年7月，在英國皇家農業博覽會上，Cogent公司正式宣布為其下屬的牧場提供奶牛分離精子的服務。Cogent擁有10臺流動細胞分揀儀，全天24h運轉，該公司分離X精子和Y精子的日產量為24億個。直至2002年，該公司已在其屬下的162個農場進行了2000頭牛的人工授精。分離精子市場處于供不應求的狀況，只能滿足其下屬的牧場。

除美國和英國外，世界上目前擁有流動細胞分揀儀的國家還有瑞士、日本、澳大利亞、德國、阿根廷等，但這些國家尚處于研究或者中試階段。

盡管目前最科學有效的分離精子的方法是流動細胞分揀儀分離法，而且分離X精子和Y精子的速度也在不斷提高。但是，要大量地應用于牛的人工授精，分離速度還是顯得較慢。因此，如何進一步提高分離速度是今后研究的重要課題。分離精子受精后的懷孕率亦需進一步提高。