DACT1基因甲基化在鼻咽癌細胞侵襲中的作用

張松 余坤飛 熊武 袁佛良 吳淑獻 潘松 周軍

DACT1基因甲基化在鼻咽癌細胞侵襲中的作用

張松 余坤飛 熊武 袁佛良 吳淑獻 潘松 周軍

目的探討DACT 1基因甲基化狀態在鼻咽癌細胞侵襲中的作用。方法采用甲基化特異性PCR及RT-PCR檢測CNE2細胞在S-腺苷-L-甲硫氨酸處理前后DACT1基因的甲基化狀態及其表達情況,用transwell小室法觀察S-腺苷-L-甲硫氨酸對CNE2細胞侵襲的影響。結果未經S-腺苷-L-甲硫氨酸處理的CNE2細胞中DACT1基因非甲基化,DACT1高表達,S-腺苷-L-甲硫氨酸處理后DACT 1基因高甲基化,DACT 1不表達,且CNE 2細胞侵襲受抑制。結論DACT 1基因甲基化狀態與其表達有關,可能在鼻咽癌細胞侵襲中起重要作用。

DACT1基因；鼻咽癌；CNE2細胞系；侵襲

最近研究發現,DACT 1(Dapper1/Dpr1)基因是一個腫瘤相關基因,其在調節腫瘤細胞的生長、增殖、侵襲及轉移中起重要作用。有研究提示,在非小細胞肺癌中DACT 1的表達與腫瘤病理分級、大小、侵襲及轉移有關。鼻咽癌中DACT 1的表達情況及其與鼻咽癌的發生、發展及轉移的關系還未見報道。本研究將通過改變DACT 1甲基化狀態改變其表達情況,觀察DACT 1基因在鼻咽癌細胞侵襲中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 CNE2細胞購于中國生命科學院上海細胞所,在5％二氧化碳、37℃的條件下,用含10％胎牛血清的1640培養基培養。在細胞處于對數生長期時用胰蛋白酶消化后分離CNE 2細胞,然后以等量接種在六孔板上,第2天,將六孔板中的6孔隨機分為兩組,一組用S-腺苷-L-甲硫氨酸處置,另一組不加任何藥物,藥物作用1 d后更換培養基繼續培養,2 d后收獲細胞用于后續實驗。

1.2 甲基化特異性PCR 上述細胞收獲后用DNA提取試劑盒提取各組細胞的DNA,然后用DNA甲基化試劑盒進行亞硫酸氫鹽修飾,根據GeneBank中DACT 1基因序列用甲基化引物設計軟件分別設計甲基化和非甲基化引物序列。甲基化引物序列(M)：5-CGGGATAGTAGTAGTCGGC-3(S),5-CGCTAAAACTACGACCGCG-3(R),非甲基化引物(U)：5-GTT GGGATAGTAGTAGTTGGT-3(S),5-AAACACTAAAACTACA ACCACA-3。分別用兩種引物對上述亞硫酸鹽修飾的各組細胞的DNA進行擴增,退火溫度分別是60℃(甲基化)和58℃(非甲基化)。分別取PCR產物10 μl用2％瓊脂糖凝膠電泳,觀察DACT 1基因甲基化情況。

1.3 RT-PCR 采用TRIzol 試劑提取上述細胞的總RNA,用逆轉錄酶進行反轉錄形成DNA第一鏈(cDNA)。根據GeneBank中基因序列分別設計DACT 1和β-actin兩對引物,分別以cDNA為模板行PCR。DACT 1引物：5-GGAAGAGGACAG GCTTGGAAAC-3(S),5-GTCCCATTGTTCAGAGAAGGTATC-3(R)；β-actin引物：5-CACCCAGCACAATGAAGATCAAGAT-3,5-CCAGTTTTTAAATCCTGAGTCAAGC-3,退火溫度均是60℃。反應結束后取PCR產物5 μl用1.5％瓊脂糖凝膠電泳,觀察DACT 1表達情況。

1.4 細胞侵襲實驗(transwell小室法) 將對照和加藥處理24 h的細胞消化制成105個/ml懸液,取1 ml 細胞懸液于1500 rpm離心5 min,棄上清。加入200 μl 無血清培養基,吹打均勻后放入transwell小室中。 Transwell板中加入500 μl含10％ FBS 1640的完全培養基,將小室放入板中。37℃下于5％ CO2培養箱中培養24 h。將小室取出,用PBS洗去培養基,結晶紫染色10 min,自來水將表面的結晶紫洗除干凈,用棉簽將上室中的細胞擦除干凈,于倒置顯微鏡下觀察,每組細胞隨機取10個視野記錄細胞數,分析觀察兩組細胞侵襲能力。

1.5 統計學方法 采用SPSS17.0統計學軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差(±s)表示,采用t檢驗；計數資料以率(％)表示,采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

甲基化特異性PCR結果顯示,未經S-腺苷-L-甲硫氨酸處理的CNE 2細胞中DACT 1基因是非甲基化的,而經過S-腺苷-L-甲硫氨酸處理的CNE 2細胞中DACT 1基因是甲基化的,這說明S-腺苷-L-甲硫氨酸能使非甲基化的DACT 1基因重新甲基化。

RT-PCR結果提示,在未經S-腺苷-L-甲硫氨酸處理的CNE 2細胞中DACT 1高表達,而在經過S-腺苷-L-甲硫氨酸處理的CNE 2細胞中DACT 1不表達,這說明S-腺苷-L-甲硫氨酸通過改變DACT 1基因的甲基化狀態而改變了其表達。

transwell小室實驗結果顯示,未經S-腺苷-L-甲硫氨酸處理的CNE 2細胞侵襲數(χ2=13.50±2.15)明顯多于經過S-腺苷-L-甲硫氨酸處理的CNE 2細胞侵襲數(χ2=8.50±1.08,t=5.868,P＜0.001)。這說明DACT 1的表達情況影響CNE 2細胞的侵襲能力。

3 討論

DACT 1基因定位于14q22.3,其編碼836個氨基酸的蛋白質,氨基端有1個亮氨酸連接區域,羧基端有1個PDZ連接位點。最近研究發現,其是1個腫瘤相關基因,其可能通過增強Bata-連環蛋白的表達,影響Wnt信號轉導途徑,調節細胞周期及凋亡,進而調節腫瘤細胞的生長、增殖、侵襲及轉移。Yuan等［1］研究發現,DACT 1在結腸癌細胞中的高表達能促進癌細胞的生長、增殖、遷移及侵襲能力。有研究認為［2］,在B細胞慢性淋巴細胞白血病細胞中DACT 1的高表達與其基因低甲基化有關。

DNA甲基化是基因表觀遺傳學修飾的一種重要方式,即在DNA序列不變的情況下調節某些特定基因組區域的轉錄活性,控制該基因的表達［3］?；騿幼訁^CpG島甲基化狀態與基因的活性有關,啟動子區域CpG島高甲基化是基因失活的主要原因之一。先前研究發現,抑癌基因DAPK及腫瘤轉移相關基因uPA的表達與其基因啟動子區CpG島甲基化狀態有關,且這些基因的甲基化狀態是可逆的,可通過調節某些酶的活性改變這些基因的表達,進而影響鼻咽癌及喉癌細胞的生長及侵襲能力［4］。本研究結果顯示未經S-腺苷-L-甲硫氨酸處理的CNE 2細胞中DACT 1基因啟動子區非甲基化,DACT 1高表達,而經S-腺苷-L-甲硫氨酸處理的CNE 2細胞中DACT 1基因啟動子區高甲基化,DACT 1不表達,且CNE細胞的侵襲能力明顯減弱。說明S-腺苷-L-甲硫氨酸在DNA復制過程中能使去甲基化的基因重新甲基化而失去表達,根據失活基因的功能而調節細胞的生長及侵襲,進而在腫瘤生長、侵襲及轉移中起重要作用。

綜上所述,DACT 1基因甲基化狀態與其表達有關,可以通過改變其甲基化狀態改變其表達,進而調控腫瘤細胞的生長及侵襲,進而調節腫瘤的進展。

［1］Yuan G,Wang C,Ma C,et al. Oncogenic Function of DACT 1 in Colon Cancer through the Regulation of b-catenin. Plos One,2012,7(3):1-17.

［2］Kong WJ,Zhang S,Guo CK,et al. Effect of methylationassociated silencing of the deathassociated protein kinase gene on nasopharyngeal carcinoma. Anti-Cancer Drugs,2006,17(3):251-259.

［3］張松,李爍,高春生. uPA基因啟動子區低甲基化在鼻咽癌侵襲轉移中的作用.腫瘤防治研究,2012,39(6):691-693.

［4］葉星星,蔡志毅,陳佳玉,等.細胞周期素G在鼻咽癌細胞中的表達及其意義. 中國衛生檢驗雜志,2010(11):165-166.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.24.218

2015-08-20］

深圳市衛生和計劃生育委員會資助項目(項目編號：201302227)

518106 深圳市光明新區人民醫院耳鼻咽喉科