人角膜基質常溫下氮氣脫細胞法的初步研究

齊飛 張曉宇 李若溪

人角膜基質常溫下氮氣脫細胞法的初步研究

齊飛 張曉宇 李若溪

目的研究室溫下對取自于角膜激光屈光手術削除的基質瓣進行無毒化脫細胞處理的方法。方法在無菌條件下收集激光屈光手術后廢棄的人角膜基質瓣。角膜瓣沖洗2～3次后置于5 ml離心管中。將離心管充滿氮氣并封管,常溫或4℃冰箱保存7 d。取出角膜瓣,再次沖洗2～3次后恒溫震蕩24 h,每隔1～2 h換液,得到脫細胞角膜基質瓣。對上述處理后的角膜基質瓣進行蘇木精-伊紅染色(HE染色)及Hoechst 33342染色以觀察脫細胞效果。結果經上述處理獲得的角膜基質瓣透明度良好,HE染色及Hoechst 33342染色未見明顯基質細胞殘留。結論本研究取材于角膜激光屈光手術削除的基質瓣,經過無毒化脫細胞處理,解決了角膜基質來源和脫細胞試劑毒性殘留的問題,有較好的臨床應用前景。

角膜；角膜基質；氮氣；脫細胞

中國公民因單眼和雙眼角膜病致盲的盲人約300～500萬,僅次于白內障,居眼科致盲疾病的第二位。導致角膜盲的主要疾病包括各種感染性角膜病、角膜變性、嚴重機械外傷、眼表化學傷、重癥干眼癥等,幾乎涵蓋了所有角膜病種。其中大部分患者獲得有用視力的唯一方法是手術治療,而手術的主要方式是角膜全層或板層移植。我國由于受到傳統觀念和眼庫條件的限制,角膜捐獻者數量有限,治療成本昂貴,并且部分角膜供體由于時間和空間的限制不能得到及時充分的利用,因此遠遠不能滿足臨床需求,給患者家庭和社會帶來巨大壓力。在角膜供體極為匱乏的情況下,利用細胞學和組織工程學手段獲得具有正常生理結構和功能的角膜組織是使這些患者脫盲的關鍵技術。本研究針對眼科臨床工作的這一重大現實問題,對角膜基質組織的去細胞技術進行了研究。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究中使用人角膜基質組織,來源于人眼經

過激光屈光手術切削除去的角膜基質瓣。

1.2 方法

1.2.1 角膜基質瓣預處理 用消毒的顯微無齒鑷將激光屈光手術中切削去的表面光滑、厚度40～140 μm、平均直徑(8±2)mm的角膜基質瓣,自手術臺上放入盛有含0.3wt％青鏈霉素的平衡鹽溶液(以下稱“洗滌液”)的1 ml規格的無菌eppendorf管中,轉移至二級B2型生物安全柜,在培養皿中注入洗滌液,取出角膜基質瓣,并在培養皿中清洗2～3次,2～5 min/次。

1.2.2 去細胞過程 將角膜基質瓣放入5 ml離心管中,使用便攜式氮氣瓶將離心管中充滿氮氣,旋緊離心管管蓋并用封管膜封管,常溫或4℃保存5～7 d；之后在無菌條件下,取出角膜基質瓣,轉移至二級B2型生物安全柜中,在培養皿中用洗滌液清洗2～3次,2～5 min/次,再在洗滌液中,在轉速150～250 rpm條件下,15～25℃恒溫震蕩處理24～36 h(恒溫震蕩培養箱,Labnet公司,型號211DS),并且每隔1～2 h換洗滌液1次,即得到脫基質細胞的角膜基質。

1.3 病理學研究 對脫細胞的角膜基質瓣進行HE及Hoechst 33342染色,觀察基質瓣微結構及有否細胞成分殘留。

2 結果

通過本方法獲得的角膜基質瓣透明度好,無明顯細胞成分殘留,基質組織結構接近正常角膜,未見明顯纖維碎裂、溶解。

3 討論

角膜表層組織包括角膜上皮層和部分基質層,其結構對維持眼表的生理功能和眼球的視覺功能具有十分重要的意義。角膜上皮目前已有多種重建方法并已應用于臨床,取得了客觀的治療效果。而角膜基質層的材料來源和脫細胞處理方式雖有多種,但存在以下問題：①角膜基質材料來自于人眼或動物眼,人角膜組織相容性最好,但全層角膜來源匱乏,而來源于動物眼的角膜基質難以避免免疫反應等問題；②為盡量降低發生免疫反應的風險,用于角膜移植的角膜基質需提前對角膜基質上的基質細胞進行脫細胞處理。脫細胞處理方式由起初的傳統凍融法發展至當今普遍應用的表面活性劑(即去污劑)洗脫法、液氮凍融法以及高靜水壓力法等,但均存在一些難以規避的問題：例如反復凍融［1］和高靜水壓力［2］處理均可能導致膠原斷裂,損傷角膜基質的張力；而表面活性劑均具有較大的毒性,處理后難以應用于臨床,目前多停留于實驗室階段。因此,尋找人角膜基質供體的可靠來源以及安全有效的脫細胞方法是具有重大臨床實際意義的問題。

關于人角膜基質供體,激光屈光手術可能是非常理想的來源。現代激光屈光手術過程中取下的角膜基質透鏡,厚度在40～140 μm左右,直徑約8 mm,光學特性、大小和操作性均符合角膜板層移植手術的要求,以往手術后即被作為醫療垃圾處理。據粗略統計,我國每年激光屈光手術量＞50萬例,且呈逐年增長的趨勢,若充分利用角膜基質透鏡治療角膜盲患者,無疑是一盞為他們指路的明燈。

對角膜基質脫細胞方法的研究已有數十年,如前所述,既往多種脫細胞方法都因其局限性而難以在臨床推廣。近年來國內外角膜病領域的學者逐漸重視到這些局限性,開始探索如液氮凍融法等對角膜基質膠原損傷較小、毒性較低的方法。而本研究與現有技術相比,其優勢在于：①全部流程中應用的藥劑均無明顯的毒性,可以最大程度保護角膜基質的生物學特性并有效地去除基質細胞。②易于操作,避免了反復凍融造成膠原斷裂而損傷組織張力。③本方法中脫去細胞碎片時是在無菌平衡鹽溶液進行恒溫震蕩的方式,能較好地保持人角膜基質內的電解質水平。

綜上所述,人角膜常溫氮氣脫細胞法具有脫細胞完全、對角膜基質膠原無損傷、全部流程中應用的藥劑均無毒性等優點,可最大程度保護角膜基質的生物學特性并有效地去除基質細胞。

［1］Shiro Amano,Naoki Shimomura,Seiichi Yokoo,et al. Decellularizing corneal stroma using N2 gas. Molecular Vision,2008(14):878-882.

［2］Sasaki S1,Funamoto S,Hashimoto Y,et al. In vivo evaluation of a novel scaffold for artificial corneas prepared by using ultrahigh hydrostatic pressure to decellularize porcine corneas. Mol Vis,2009,13(15):2022-2028.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.24.054

2015-07-21］

沈陽市科技計劃(項目編號：F12-193-9-23),沈陽市科技計劃(項目編號：F13-317-6-09)

110847 遼寧中醫藥大學(李若溪)；沈陽市第四人民醫院(齊飛 張曉宇 李若溪)

李若溪