淺談豬圓環病毒病的實驗室診斷技術

朱雅寧 趙靜 尹春博（天津市動物疫病預防控制中心 300402）

淺談豬圓環病毒病的實驗室診斷技術

朱雅寧 趙靜 尹春博（天津市動物疫病預防控制中心 300402）

鑒于我國豬圓環病毒感染一直呈上升趨勢，已經給我國的養豬業造成相當大的經濟損失，為了加強對豬圓環病發病的監測和控制，本文綜述了國內外運用血清學和分子生物學方法檢測豬圓環病毒的成果，包括ELISA、C-ELISA、間接免疫熒光試驗、PCR、PCR-RFLP及ISH等，便于全面了解豬圓環病毒的診斷技術研究進展。

豬圓環病；血清學；分子生物學；檢測技術；方法

豬圓環病毒病（Porcine circovirus disease，PCVD），是由豬圓環病毒（Porcine circovirus，PCV）感染引起的重要傳染病。PCV是1978年由德國學者Tischer等首次從豬腎傳代細胞系PK-15細胞（ATCC CCL31）中發現的，并將其命名為豬圓環病毒（PCV）。隨后，經血清學調查發現在德國、加拿大、英國、美國等國的豬群中PCV抗體陽性率很高，其中，1997年加拿大學者Ellis，Clark等從加拿大西部患有斷奶仔豬多系統衰竭綜合征的豬群中分離到一種新的病毒，該病毒類似于PK-15細胞來源的PCV，為便于區別，Allan等將其稱為PCV2型（Porcine circovirus disease 2，PCV2），而將以前從傳代細胞系 PK-15中分離獲得的 PCV稱為 1型（Porcine circovirus disease 1，PCV1）。PCV1和PCV2病毒基因組為單鏈DNA，大小分別為1759bp和1768bp；PCV1和PCV2核苷酸序列的同源性不高，但其基因組結構相似。PCV1無致病性，廣泛存在于豬體內和豬的傳代細胞系；而PCV2與豬的多種疾病綜合征相關。

目前，我們對PCV的診斷主要是先通過臨床癥狀結合病理變化進行初步判定，但確診還須經實驗室檢驗，實驗室檢驗主要有血清學和分子生物學方法。

1 血清學檢測技術

血清學檢測技術主要應用血清學方法檢測組織病料或培養物中的PCV，主要包括ELISA、C-ELISA及間接免疫熒光試驗等方法。

1.1 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）

2000年，朗洪武等用加拿大的PCV2克隆化特異性表達抗原、陽性血清、陰性血清，按常規ELISA法進行PMWS抗體的檢測，被檢血清1：400稀釋，陽性和陰性對照血清1：100稀釋，當被檢樣品的OD值3倍于陽性對照OD值時判為陽性，否則為陰性，證明ELISA的靈敏度較高。

1.2 競爭性酶聯免疫吸附試驗（C-ELISA）

2000年，Walker等首次利用PCV1和PCV2特異性單克隆抗體建立了競爭ELISA（C-ELISA）方法來檢測PCV2抗體。他用細胞培養的PCV2作為抗原，用PCV2特異性單克隆抗體作為競爭試劑成功地建立了C-ELISA方法，并將該方法和間接免疫熒光方法相比較。檢測結果表明，C-ELISA方法的檢出率為 99.58%，而間接免疫熒光的檢出率僅為97.14%，說明該方法比免疫熒光方法更敏感，可用于PCV抗體的大規模監測。

1.3 間接免疫熒光試驗（IFA）

IFA是一種比較特異的血清學方法，主要用于病毒分離效果的鑒定及檢測病變組織或豬源細胞PCV的感染情況，既可檢測群特異性抗原又可檢測型特異性抗原。

按Allan等報道的方法進行。將病料接種PK-15細胞或病變組織冰凍切片，丙酮固定，用兔抗高免血清與細胞培養物反應，同時設非感染PCV的正常PK-15細胞或正常組織切片的對照，可對PCV進行檢測和定型。如鏡檢出現特異熒光則證明細胞中有PCV病毒存在，即為PCV陽性。IFA快速簡單，花費較少，應用非常廣泛。

2 分子生物學檢測技術

分子生物學檢測技術主要應用分子生物學方法檢測組織病料或培養物中的病毒核酸，主要包括PCR、PCR-RFLP及ISH等方法。

2.1 聚合酶鏈式反應技術（PCR）

2.1.1 常規PCR方法

設計一對PCV特異引物，直接從病料或細胞中擴增PCV特異的基因組片段，以達到特異檢測PCV感染的目的。

呂艷麗等根據PCV2的基因序列設計一對特異的PCR引物進行PCR檢測，建立了特異的PCR診斷方法。該方法可以檢測細胞和組織中的PCV2病毒核酸。

2.1.2 多重PCR（Multiplex PCR）

多重PCR是一種特殊的PCR技術，它可以簡單、方便地同時檢測2種或2種以上的病毒DNA，即在同一反應中加入多對引物，擴增多個目的基因片段。該方法方便、快捷，已廣泛用于醫學臨床，給疾病的快速診斷帶來了方便。

2001年，蘆銀華等根據發表的PCV基因序列，合成3條引物，建立了復合PCR法。在試驗中，他們在同一體系中用三條引物擴增出了PCV1和PCV2的DNA片段，從而達到了PCV擴增一次就可檢測鑒別PCV1和PCV2的目的。

2.2 PCR-限制性長度多態性（RFLP）分析方法

該法分兩步，首先進行PCR擴增，引物為PCV1與PCV2的共同引物；然后是用一定的限制性內切酶對PCR產物進行酶切，電泳觀察片段差異，從而確定PCV的類型（PCV1或PCV2）。

Fenaux等根據已有的PCV株的基因序列，建立了通用的PCR-RFLP分析方法，該法不但可以用PCV2的致病性研究，而且可以用來檢測不同地域的PCV2的感染情況。Hamel等借助于RFLP建立了可以分型的PCR診斷方法，很容易檢測PCV1和PCV2。他根據已發表的所有PCV基因組的保守序列設計引物，對PCV1和PCV2毒株的基因均擴增出了438bp的基因片段，這些片段經RFLP分析很容易鑒定和區分PCV2毒株的基因型。

2.3 原位雜交實驗（ISH）

根據所用探針的特異性不同，可將ISH方法分為3類，包括同時檢測PCV但不能進行分型的ISH；可對PCV1和PCV2進行分型的ISH及檢測PCV2與PPV或PRRSV混合感染的ISH。

2000年，Nawagitgul根據PCV2的ORF1和ORF2的有義鏈和反義鏈合成了能區分PCV1和PCV2的核酸探針。在58℃下，ORF1反義鏈探針與感染細胞中PCV1和PCV2都雜交，而ORF2反義鏈探針與感染細胞中PCV2雜交，不與PCV1核酸雜交；ORF1和ORF2有義鏈只與PCV2核酸雜交。反義鏈探針產生的信號比有義鏈強，研究表明ORF1反義鏈探針適合檢測PCV1和PCV2；ORF2反義鏈探針可區分PCV1和PCV2。

3 討論

（1）生產中根據臨床癥狀和病理變化只可作出初步診斷，因豬群中普遍存在PCV2的抗體，單一的抗體陽性不能確診為陽性，確診必須依靠實驗室方法檢測出病毒的抗原或核酸。但檢測方法多種多樣，各有優缺點，結果也不完全一致，實踐中可根據實際情況選用上述方法中的一種或兩種方法進行確診。

（2）2000年以來，我國PCV2感染一直呈上升趨勢，已經給我國的養豬業造成相當大的經濟損失。目前，對PCV2的發病機制和免疫機理目前還不清楚，而且未發現一種有效的消毒劑能徹底消滅PCV2病毒，沒有有效的疫苗可用于預防和治療PCV2造成的感染。因此，研究敏感、特異、適于大規模檢測的診斷方法和開展有效疫苗的研制是預防和控制該病的一個亟待解決的課題。

朱雅寧（1982.3-），女，大學本科，獸醫師，主要從事實驗室檢測工作。