PCR技術在畜產品安全檢測中的應用

馬艷榮（新疆維吾爾自治區阿克蘇地區動物疫病控制診斷中心 843000）

PCR技術在畜產品安全檢測中的應用

馬艷榮（新疆維吾爾自治區阿克蘇地區動物疫病控制診斷中心 843000）

隨著世界經濟全球化、貿易自由化和農產品國際貿易的迅速發展，畜產品安全已成為事關人民健康和構建和諧社會的重大戰略問題，及時、安全、準確地檢測出農產品中的病原微生物是農產品安全檢測的重要內容。隨著畜產品分析物質的不斷微量和痕量化，畜產品基質的不斷復雜化，僅使用傳統分析技術已難以解決所有的問題。

1 PCR在肉中致病微生物檢測的應用

加強畜禽肉和水產品的檢驗檢疫，保證其食用安全，是預防食源性疾病暴發的重要途徑。PCR技術有快速、特異、敏感等特點，因而該技術在肉食品中致病菌的檢測方面具有很大的應用潛力。部分常見食源性病原微生物的PCR檢測已有相應的商品試劑盒出售。大量研究表明，PCR技術在對食品中病原微生物的確證試驗方面與傳統培養方法相比至少具有相同的靈敏度，而多數情況下則表現出更高的靈敏度，而且檢測周期大為縮短。建立熒光PCR方法、實時PCR方法、多重PCR等方法可簡便、快速、靈敏地實現對腸出血性大腸桿菌，單增李氏菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的細菌學診斷快速、簡便、經濟，有較大的應用價值。

隨著分子生物學技術的不斷發展，多重PCR、標記PCR、不對稱PCR等多種不同的PCR方法都被應用于畜產品檢測中，它們的應用使PCR技術擁有了更高的靈敏度和更短的周期。

2 PCR在鮮肉及肉制品肉的種屬來源鑒定的應用

隨著社會經濟的快速發展，消費者對食品質量與安全性的要求也越來越高，席卷歐洲 “馬肉風波”、瘋牛病、禽流感等疾病的出現以及宗教、經濟健康原因和市場監管，都急需一種快速、準確的檢測方法以對肉制品、寵物食品和肉骨粉等所含肉的成分進行種屬鑒定。當前，對研究者、消費者、食品工業和政策制定者等各個方面來說，食品的真偽都是一個熱點問題，尤其是肉類工業。PCR技術具有特異性強、敏感性高、操作簡便、快速高效等特點，在肉類摻假檢測方面具有巨大的應用價值。目前所采用的感官檢驗和免疫學方法可鑒別生鮮肉的種屬，但對熱加工處理的肉類，由于其感官性狀、蛋白質成分和其他免疫原性物質被破壞而難以鑒別，因此熟肉種類與飼料中牛羊肉成分的種屬鑒別一直是亟待解決的難題。

動物品種的鑒定方法主要從蛋白和核酸兩個層次進行。以蛋白為基礎的方法主要包括十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS PAGE）等電聚焦電泳和免疫學方法。以核酸為基礎的方法包括物種特異引物多重PCR、熒光PCR、聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）等。

20世紀80年代，國外開始對肉的種屬鑒定進行研究，初期的研究對象主要是生豬肉和牛肉。采用的方法主要有DNA雜交、免疫擴散和等電點聚焦等。這些方法中，DNA雜交和免疫擴散靈敏度高。但DNA雜交試驗方法復雜，耗時長；免疫擴散不能夠檢測出有親緣關系的肉類品種，比如山羊與綿羊，水牛與普通黃牛。同時對經過加工的制品檢測效果不佳；等電聚焦速度快，但靈敏度稍差，成本高，工作量大且不易準確定量。

物種鑒定的關鍵因素是選擇合適的分析基因。肉類食品在加工過程中經過加熱、高壓、輻射等處理后，DNA發生斷裂，提取的DNA減少。Arslan A研究證實，烹煮、烘烤、壓力處理、油煎等烹飪過的牛肉制品通過提取其線粒體中271bp的DNA片段，而后經過PCR擴增也可以鑒別出來，但是高溫的非水烹調肉可能用PCR無法檢測，因為高溫使肉碳化、DNA變性。

目前用于肉類食品成分鑒定的基因通常位于線粒體（mtDNA）上，包括細胞色素 b（Cytb）基因、12SrDNA、16SrDNA、D-loop基因等。T.Matsunaga等（1999）利用Cytb來設計引物擴增基因片段，并將山羊、雞、牛、綿羊、豬和馬的基因混合，正向引物（Forward primer）在Cytb的保守DNA序列上設計，反向引物（Reveserprimer）采用幾個物種各自特有的DNA序列來進行多元PCR反應，所得的擴增片段可用于鑒別幾種物種。高琳（2008）等以動物線粒體DNA中Cytb區段的保守序列為目的基因進行PCR-RFLP，從6種生肉及7種加工肉制品中鑒別出豬源性和牛源性成分。所有樣品經PCR擴增均產生359bp的片段。擴增子采用Alu I限制性酶切所產生的片段差異可用于區分豬肉和牛肉。

肉骨粉是牲畜屠宰后其毛纖維、皮革、角質、骨骼、臟器等非食用組織經由高溫蒸煮后再揮干水分的成品，是重要的動物蛋白飼料，在養殖領域使用極為廣泛。目前國內外已經建立了許多從飼料里鑒別動物源性成分的方法，其中以PCR方法最為靈敏和準確。李文靜等分別運用特異性引物，針對牛、羊、豬和雞的線粒體基因中的某一片斷進行擴增，建立了鑒別四種動物源性成分的PCR方法，用每種動物的特異性引物跟其它動物的DNA進行PCR擴增，結果沒有擴增出非特異條帶，說明選用的牛的引物和自己設計的三種引物都具有特異性，檢出的牛肉骨粉的最低含量約為0.001%。證明該方法具有快速、靈敏度高和特異性強等優點，可以作為鑒定肉骨粉種類的常規方法。

綜上所述，PCR方法以其快速、靈敏、操作簡單、節省費用等特點逐漸成為質檢部門檢測的主要方法，PCR方法尤為突出的優點在于解決了傳統方法的困難，使致病微生物的檢測，熟肉、熟肉制品的種類鑒定成為可能，為市場肉類管理、動物檢疫、刑偵等提供了快速、可靠、方便的手段。

馬艷榮（1981.1-），女，漢族，大學本科，獸醫師，從事獸醫實驗室檢測工作。