淋巴細(xì)胞免疫表型聯(lián)合CCL-2水平檢測(cè)對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的診斷價(jià)值

宋麗，穆春華，陸曉媛

(1徐州醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，江蘇徐州221002;2泗陽(yáng)縣人民醫(yī)院;3徐州醫(yī)學(xué)院)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RSA)是一類(lèi)常見(jiàn)的妊娠疾病，其發(fā)生與多種因素相關(guān)。趨化因子在調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移和侵襲、促進(jìn)胎盤(pán)形成、調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞等方面具有重要作用;當(dāng)趨化因子和(或)趨化因子受體表達(dá)量或活性異常時(shí)，可能導(dǎo)致胚胎的早期丟失。目前研究顯示，淋巴免疫表型與RSA的發(fā)生具有一定的聯(lián)系，但具體機(jī)制尚不明確。為此，本研究對(duì)RSA患者外周血淋巴細(xì)胞表型及趨化因子水平進(jìn)行了研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2012年8月～2013年8月在徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科門(mén)診就診的RSA患者60例(RSA 組)，年齡22～38(31.1±5.7)歲。超聲診斷發(fā)現(xiàn)胚胎發(fā)育停止或者枯萎，無(wú)胎心搏動(dòng)，確診流產(chǎn)。患者均符合RSA的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn):流產(chǎn)次數(shù)超過(guò)2次，染色體檢查正常，內(nèi)分泌系統(tǒng)無(wú)異常，無(wú)子宮疾病。另選取同期終止妊娠的健康婦女30例作為對(duì)照組，年齡 21 ～39(30.3 ±4.3)歲，無(wú)流產(chǎn)史，染色體正常，婦科檢查指標(biāo)正常。兩組年齡、孕周等差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 RSA組及對(duì)照組抽取靜脈血5 mL，然后進(jìn)行吸宮手術(shù);吸宮手術(shù)收集的絨毛及蛻膜組織處理后立即用液氮冷卻，低溫保存。

1.2.2 淋巴免疫表型分布檢測(cè) 靜脈血經(jīng)處理后，加入熒光標(biāo)記CD127鼠抗人單抗各20 μL，避光15 min后加入500 μL溶血素，PBS洗滌離心棄去上清，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.3 血清CCL-2水平檢測(cè) 參照雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析方法的一般操作要求，對(duì)患者血清標(biāo)本進(jìn)行CCL-2水平檢測(cè)，采用酶標(biāo)儀450 nm測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算CCL-2濃度。

1.2.4 絨毛、蛻膜組織CCL-2表達(dá)檢測(cè) 采用蛋白免疫印跡法，參照試劑盒操作規(guī)程檢測(cè)絨毛、蛻膜組織CCL-2表達(dá)情況。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，兩組間符合正態(tài)分布資料比較采用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布資料采用秩和檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清淋巴免疫表型比較 見(jiàn)表1。

表1 兩組血清淋巴免疫表型比較(%，±s)

表1 兩組血清淋巴免疫表型比較(%，±s)

組別 n CD+3 CD+4 CD+8 CD+16CD+56 CD+4CD+25CD127 RSA 組 60 56.5 ±5.6 38.1 ±6.6 25.6 ±3.1 23.2 ±2.3 7.9 ±1.2對(duì)照組 30 51.0 ±4.1 30.5 ±2.5 22.9 ±4.1 18.2 ±1.7 10.6 ±1.8 t 2.79 3.15 2.56 4.15 3.25 P 0.031 0.027 0.068 0.015 0.026

2.2 兩組血清 CCL-2水平比較 RSA組、對(duì)照組 血清CCL-2水平分別為(16.1±2.1)、(9.8±4.1)g/L，RSA組CCL-2水平高于對(duì)照組(P＜0.05)。

2.3 絨毛、蛻膜組織CCL-2表達(dá)情況 RSA組絨毛及蛻膜組織中CCL-2呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，高于對(duì)照組表達(dá)水平。見(jiàn)圖1。

圖1 及對(duì)照組絨毛及蛻膜組織中CCL-2的表達(dá)情況

3 討論

妊娠是指胚泡和母體組織結(jié)合的一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，類(lèi)似于器官移植，將父母雙方的抗體抗原進(jìn)行融合、識(shí)別，并產(chǎn)生相關(guān)作用的一個(gè)過(guò)程［1］。免疫學(xué)認(rèn)為，妊娠的過(guò)程是父方抗原成分與母體免疫系統(tǒng)識(shí)別產(chǎn)生免疫應(yīng)答的過(guò)程［2］，但是妊娠結(jié)局與器官移植產(chǎn)生的免疫應(yīng)答不同，它是一種特殊類(lèi)型的同種異體移植。因此，胚胎與母體之間的免疫平衡是妊娠成功與否的關(guān)鍵。大量的研究證明，妊娠失敗多與母體的免疫排斥有關(guān)，當(dāng)胚胎與母體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生排斥，母體免疫系統(tǒng)會(huì)發(fā)生免疫應(yīng)答，產(chǎn)生免疫耐受，導(dǎo)致進(jìn)一步的妊娠失敗。但是，RSA與免疫應(yīng)答及與何種免疫表型具有關(guān)聯(lián)，仍然是臨床研究的熱點(diǎn)問(wèn)題［3］。

RSA是無(wú)明顯病理原因的多次流產(chǎn)，其產(chǎn)生的原因復(fù)雜［4～6］，臨床常見(jiàn)的是免疫性和非免疫性RSA。非免疫性的RSA主要表現(xiàn)為染色體異常、生殖系統(tǒng)異常;而免疫性的RSA主要表現(xiàn)為免疫功能紊亂，其中還包括自體免疫性RSA和非自體免疫型RSA。目前關(guān)于RSA與免疫因子的關(guān)系尚不清楚，本研究希望通過(guò)RSA患者與正常人群的淋巴免疫表型的差異，尋找RSA的免疫應(yīng)答機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，RSA 患者中分布與對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，RSA患者淋巴細(xì)胞免疫表型以為主。但是，本研究?jī)H用流式細(xì)胞儀對(duì)血清中的免疫細(xì)胞進(jìn)行了熒光標(biāo)記，樣本量較小，其結(jié)果的真實(shí)性仍然需要進(jìn)一步研究。

CCL-2是一類(lèi)較為常見(jiàn)的趨化因子，與免疫系統(tǒng)應(yīng)答有一定聯(lián)系。趨化因子在調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移和侵襲，促進(jìn)胎盤(pán)形成，調(diào)節(jié)外周血淋巴細(xì)胞遷移、募集和歸巢中起著決定性的作用［7］。當(dāng)趨化因子和(或)趨化因子受體表達(dá)量或活性異常時(shí)，可能導(dǎo)致胚胎的早期丟失。研究表明，趨化因子與母胎之間存在非常緊密的聯(lián)系，在胚胎著床及生長(zhǎng)過(guò)程中，趨化因子產(chǎn)生非常重要的作用［8］。免疫學(xué)的深入研究顯示，RSA與免疫應(yīng)答具有密切的聯(lián)系［9～11］;同時(shí)，RSA 與胚胎周?chē)植抗δ墚惓５募?xì)胞分泌細(xì)胞因子有關(guān)，并在調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移侵襲、促進(jìn)胎盤(pán)形成的過(guò)程中起到關(guān)鍵作用［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，RSA患者血清CCL-2水平明顯高于對(duì)照組，在絨毛及蛻膜組織中CCL-2也呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，進(jìn)一步印證了RSA患者的趨化因子異常。

綜上所述，淋巴細(xì)胞免疫表型聯(lián)合CCL-2水平檢測(cè)對(duì)臨床診斷RSA有重要作用。

［1］O'Hara MH，F(xiàn)razier LM，Stembridge TW，et al.Physician-led，hospital-linked，birth care centers can decrease cesarean section rates without increasing rates of adverse events［J］.Birth，2013，40(3):155-163.

［2］Allison JL，Schust DJ.Recurrent first trimester pregnaney1055:revised definitions and novel causes［J］.Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes，2009，16(6):446-450.

［3］張洲，師娟子，邢俊平，等.RSA與精液常規(guī)參數(shù)、精子畸形率和DNA完整性的相關(guān)性［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，23(16):3674-3677.

［4］Yilmaz SD，Bal MD，Beji NK，et al.Women＇s preferences of method of delivery and influencing factors［J］.Iran Red Crescent Med J，2013，15(8):683-689.

［5］Kayashima K，Sozen R，Okura D.Insufficient sugammadex effect in an obese pregnant woman undergoing cesarean section under general anesthesia［J］.Masui，2014，63(2):188-190.

［6］Halder S，Samanta B，Sardar R，et al.Tranexamic acid used before caesarean section reduces blood loss based on pre-and postoperative haemoglobin level:a case-control study［J］.J Indian Med Assoc，2013，111(3):184-186.

［7］李金科，劉興會(huì).RSA檢查和治療的循證評(píng)價(jià)［J］.中國(guó)實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志，2013，12(2):691-693.

［8］Leung S，Liu XB，F(xiàn)ang L，et al.The cytokine milieu in the interplay of pathogenic Th1/Th17 cells and regulatory T cells in autoimmune disease［J］.Cell Mol Immunol，2010，7(3):1-8.

［9］楊君，王慧玲，華方方.RSA與蛻膜組織中妊娠相關(guān)血漿蛋白A的關(guān)系研究［J］.中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2013，18(32):2101-2103.

［10］黃劍青，陳惠霞，葉敏儀，等.淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療不明原因RSA患者治療效果觀察［J］.安徽醫(yī)藥，2014，25(5):1561-1564.

［11］李莉，鄒佑軍，鄧瓊.Th1和Th2細(xì)胞因子在RSA患者血清中的表達(dá)及其與孕激素水平的關(guān)系［J］.寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，25(12):681-683.

［12］李俊霞，張鈺，王建梅，等.血清 CXCL12、CCL2、RANTES和孕酮在胚胎發(fā)育不良早期診斷中的作用［J］.中國(guó)婦幼保健，2013，16(25):881-885.