大黃多糖對大鼠動脈硬化形成中Toll樣受體4表達的影響

梁景巖 王小洪 王英歌

(江蘇省揚州大學醫學院 225001)

動脈粥樣硬化［1］是一種由于動脈壁慢性炎癥所引起的腦血管疾病，近年來，呈逐年上升趨勢。該病具有較高的發病率及致死率，給患者帶來了很大的痛苦。研究發現［2］，動脈粥樣硬化的發病與多種感染因素有關。專家報道［3］，Toll樣受體4是可能是引起動脈粥樣硬化的橋梁因素。大黃多糖是中藥大黃的水溶性成分之一，研究表明，其在抗動脈粥樣硬化方面作用顯著。基于此，筆者擬觀察大黃多糖對大鼠動脈粥樣硬化形成的干預作用，并從受體角度探討其對Toll樣受體4表達的影響，為臨床研究提供依據。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 大鼠，SD，雄性，體重280～300g;由山東魯抗醫藥股份有限公司實驗動物室提供，生產許可證號:SCXK(魯)20130001。

1.2 藥物和試劑 大黃多糖(西安天園生物制劑廠提供，批號Z20140426)，維生素D3顆粒(上海通用藥業股份有限公司提供，批號H31021404)，甲醛溶液(煙臺三和化學試劑有限公司提供，批號H20140423)，水合氯醛(天津市科密歐化學試劑開發中心提供，批號H20141028)，無水乙醇(杭州永星五交化有限公司提供，分析純，批號H20141121)，蘇丹Ⅲ(上海酶聯生物科技有限公司提供，批號H20140824)，二甲苯(淄博豐倉化工有限公司提供，批號H20141121)，蘇木素(廣州深達生物制品技術有限公司提供，H20130911)。高脂飼料(由山東魯抗醫藥股份有限公司實驗動物室提供)。

1.3 儀器 石蠟切片機(由北京科思佳公司通用儀器網提供)，KPJ-1B生物組織烤片機(由上海珂淮儀器有限公司提供)，LY-WN-HP CCD萬能視頻成像裝置(由四川省實驗室信息平臺提供)，9701型PCR儀(由賽飛(中國)有限公司提供)。

1.4 方法

1.4.1 分組造模及給藥 SD大鼠48只正常飼養3天后，將其隨機分為4組，即為空白組、模型組、大黃多糖小、大劑量組。空白組進行常規飼養2個月，不造模。模型組大鼠灌胃給予維生素D3顆粒(0.75mg/kg)，并采用高脂飼料喂養2個月。大黃多糖小、大劑量組均灌胃給予維生素D3顆粒(0.75mg/kg)，同時分別灌服大黃多糖小、大劑量(0.01g/kg)、(0.04g/kg)，兩組大鼠亦采用高脂飼料喂養2個月。上述各組均正常喂水。4周后，在模型組中隨機抽樣2只大鼠，解剖并取出其主動脈弓至腹主動脈處血管，作病理切片，HE染色，若在鏡下可見泡沫細胞形成且有鈣鹽沉積，說明造模成功。2個月后，用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，解剖并取出其主動脈弓至腹主動脈處的血管，并將每只大鼠的血管分為2部分，一部分用10%甲醛固定后石蠟包埋，切片，進行HE染色，光鏡觀察血答壁 AS病變，運用 LY-WN-HP CCD萬能視頻成像裝置進行形態學分析，測量并計算粥樣斑塊面積。另一部分低溫下洗凈剪碎，零下80℃低溫保存備用。

1.4.2 PCR檢測Toll樣受體4 mRNA表達 提取大鼠血管組織總RNA，其中，總RNA提取試劑盒(TRIzol法)由上海江萊生物科技有限公司提供。選β-actor為內參，引物由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司提供。其中，Toll樣受體4引物包括上游引物5＇-TTTATTCAUAUCCUTTUG3＇和下游引物 5＇-AUTTUCCUTTTCTTUTTC-3＇;βactor引物包括上游引物 5＇-CCTUTATUCCTCTGUTG3＇和下游引物 5＇-TCTTTACUUATUTCAACG3＇。反應條件:50℃下反轉錄20 min，94℃預變性3min，94℃變性 40s，53℃退火45s，72℃延伸8min，進行35次循環。反應結束后，采用圖像分析系統檢測Toll樣受體4的相對表達量。

1.5 統計學處理 采用SPSS19.0統計軟件進行分析，計量資2料用±S表示，采用t檢驗，計數資料用率表示，采用χ 檢驗，以P＜0.05差異顯著有統計學意義。

2 結果

2.1 大黃多糖對大鼠主動脈壁動脈粥樣硬化形成的抑制作用 經HE染色結合半定量分析可知，模型組動脈粥樣硬化斑塊面積10.1%明顯高于空白組且差異顯著(P＜0.05)，說明造模成功。大黃多糖小、大劑量組動脈硬化面積明顯低于模型組且差異顯著(P＜0.05)，大黃多糖大劑量組動脈硬化面積與小劑量組相比明顯減少且差異顯著(P＜0.05)，說明大黃多糖可明顯抑制大鼠動脈硬化的形成，并與劑量有一定關系。結果見表1。

表1 大黃多糖對大鼠主動脈壁動脈粥樣硬化形成的抑制作用(%)

2.2 大黃多糖對動脈硬化大鼠主動脈壁Toll樣受體4相對表達量的影響 經RCR檢測結合圖像分析系統結果顯示，與空白組相比，模型組Toll樣受體4相對表達量明顯升高且差異顯著(P＜0.05)，說明造模成功。與模型組相比，大黃多糖小、大劑量組Toll樣受體4相對表達量明顯降低且差異顯著(P＜0.05)，且大黃多糖大劑量組Toll樣受體4相對表達量與小劑量組相比明顯減少且差異顯著(P＜0.05)，說明大黃多糖可使動脈硬化大鼠主動脈壁Toll樣受體4相對表達量降低。結果見表2。

表2 大黃多糖對動脈硬化大鼠主動脈壁Toll樣受體4相對表達量的影響(±S)

表2 大黃多糖對動脈硬化大鼠主動脈壁Toll樣受體4相對表達量的影響(±S)

注:與空白組相比，*P＜0.05;與模型組相比，＊＊P＜0.05;與小劑量組相比，▲P ＜0.05。

組別 n 劑量(g/kg) Toll樣受體4相對表達量空白組12 0.21 ±0.02模型組 12 0.72 ±0.19*大黃多糖小劑量組 12 0.01 0.62 ±0.12＊＊大黃多糖大劑量組 12 0.04 0.19 ±0.10＊＊▲

3 討論

動脈粥樣硬化是一種常見的腦血管疾病，其發病機制與多種因素有關。目前，“損傷反應學說”［4］逐漸被臨床認可，該學說認為慢性炎癥和血脂代謝紊亂是動脈粥樣硬化的2個主要特點。近年來，有研究證實［5］，慢性炎癥反應與心血管疾病關系密切。Toll樣受體4［6］是發現最早的Toll樣受體亞型之一，該物質能夠直接介導機體與病原體之間的反應，是引起炎癥反應的關鍵分子。有專家指出［7］，動脈粥樣硬化本身就是一種炎性疾病。有研究顯示［8］，在動脈粥樣硬化斑中，Toll樣受體4的表達明顯升高，并證實導致動脈粥樣硬化的細胞因子的合成與釋放與Toll樣受體4的識別功能有關。大黃多糖是中藥大黃的有效成分之一，可通過抑制血管平滑肌細胞的增殖達到抗動脈粥樣硬化的作用，實驗證實［9］，大黃多糖可抑制血小板聚集，抑制細胞鈣離子內流，改善血液流變學特性。另有研究表明［10］，大黃多糖一定的抗炎作用。本研究結果顯示，經HE染色結合半定量分析可知，模型組動脈粥樣硬化斑塊面積明顯高于空白組且差異顯著(P＜0.05)，說明造模成功。大黃多糖小、大劑量組動脈硬化面積明顯低于模型組且差異顯著(P＜0.05)，大黃多糖大劑量組動脈硬化面積與小劑量組相比明顯減少且差異顯著(P＜0.05)，說明大黃多糖可明顯抑制大鼠動脈硬化的形成，并與劑量有一定關系。經RCR檢測結合圖像分析系統結果顯示，與空白組相比，模型組Toll樣受體4相對表達量明顯升高且差異顯著(P＜0.05)，說明造模成功。與模型組相比，大黃多糖小、大劑量組Toll樣受體4相對表達量明顯降低且差異顯著(P＜0.05)，且大黃多糖大劑量組Toll樣受體4相對表達量與小劑量組相比明顯減少且差異顯著(P＜0.05)，說明大黃多糖可使動脈硬化大鼠主動脈壁Toll樣受體4相對表達量降低。

綜上述，大黃多糖具有抗動脈硬化作用，且其抗動脈硬化的作用機制可能與抑制動脈壁Toll樣受體4的表達有關。但是，由于樣本量有限，更深入的研究尚需后續研究進一步證實。

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［7］李建軍.炎癥與動脈粥樣硬化.中國醫學前沿雜志，2011，3(5):4-6.

［8］何文芳，曾建斌，雷云宏.Toll樣受體4表達在冠狀動脈粥樣硬化中的意義.實用心腦肺血管病雜志，2014，22(8):166-168.

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［10］馮娟，栗艷，孫陽，等. 大黃多糖抑制脂多糖引起的TLＲ-4 /NF-KB 通路活化. 現代生物醫學進展，2014，14 ( 31) : 6035 - 6937.