脂肪干細胞提取方法的改良

胡金靈　邵世飚　梁廷波

·實驗研究·

脂肪干細胞提取方法的改良

胡金靈邵世飚梁廷波

目的 探索一種簡單高效的脂肪干細胞提取方法。方法 實驗動物選取SD大鼠，在傳統脂肪干細胞提取方法的基礎上提高膠原酶濃度并省略裂解紅細胞及篩網濾過步驟作改良，比較兩種提取方法所用時間、提取的脂肪干細胞數量、生物學特性、傳代及分化能力等。結果 改良法提取脂肪干細胞用時70min，提取5瓶原代細胞，未污染，細胞3d后傳代，子代細胞生長良好，成功誘導分化為脂肪細胞。結論 改良法提取脂肪干細胞能夠顯著增加細胞提取數量，縮短提取時間，降低原代細胞污染率，不影響細胞生物學特性及分化能力，是一種簡單高效的脂肪干細胞提取方法。

脂肪干細胞 改良 提取

各種急慢性肝病已經成為危害人類健康的重要疾病，目前世界上對于肝病的治療主要采取維持和支持療法，肝移植因供體的缺乏、費用昂貴以及尚存在免疫排斥等問題尚未解決。近年來，人們發現脂肪組織中含有一種多功能干細胞，即脂肪干細胞（adiposederived stem cells ADSCs），它不僅在細胞生長動力學，細胞衰老、基因轉導和橫向分化能力等方面與骨髓間充質干細胞（mesenchmal stem cells MSCs）非常相似，且還具有來源廣泛，容易大量獲得，取材方便，給患者帶來的痛苦小等優點［1～3］。作者自2010年8月至2013年8月在脂肪干細胞提取過程中，經過反復實驗和不斷改進，摸索出一種比較理想的提取方法，現介紹如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物與材料 成年SD大鼠，雌雄不限，200g左右，由浙江省醫學科學院提供。Ⅰ型膠原酶、油紅O、胰島素、地塞米松、吲哚美辛、異丁基甲基黃嘌呤均購自美國Sigma公司；胎牛血清（FBS）、DMEM培養基購自美國Gibco公司；CO2培養箱、超凈工作臺、倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。基礎培基：DMEM+10%FBS+100U/ml青霉素+100U/ml鏈霉素，誘導培養基：DMEM+10%FBS+100U/ml青霉素+100U/ml鏈霉素+10μg/ml胰島素+1μmoL/L地塞米松+0.5mmoL/L異丁基甲基黃嘌呤+200μmoL /L吲哚美辛。

1.2實驗方法 （1）脂肪碎片制備：動物稱重后，水合氯醛過量麻醉處死，無菌條件下取出腹股溝處脂肪墊，盡量剔除軟組織和小血管，PBS緩沖液沖洗3～5次。將脂肪組織剪成小塊，PBS緩沖液反復沖洗，制備兩等份脂肪組織碎片。（2）脂肪干細胞傳統提法：將上述一份脂肪組織碎片在37℃下由0.075%I型膠原酶消化60min，含10%FBS的DMEM 等體積中和，1000轉/min離心10min后棄去上清液，160mmol/L NH4Cl裂解紅細胞10min，離心棄去上清液，含10%FBS的DMEM重懸細胞，200目篩網過濾后離心，基礎培養基重懸后分別接種至3只培養瓶。48h后第一次換液，此后每3d更換培養基，細胞生長至亞融合狀態時傳代，37℃下0.25%胰酶消化，離心棄上清液，基礎培養基重懸細胞，細胞懸液1：2接種至培養瓶，每3d更換培養基。（3）脂肪干細胞改良提法：將上述另一份脂肪組織碎片在37℃下由0.25%I型膠原酶消化30min（消化開始，計時器開始計時），含10%FBS的DMEM等體積中和，1000轉/min離心10min后棄去上清液，基礎培養基重懸細胞后分別接種至5只培養瓶（計時器停止計時）。48h后換液，除去未貼壁細胞，此后每天更換培養基，細胞生長至亞融合狀態時傳代，37℃下0.25%胰酶消化，離心棄上清液，基礎培養基重懸細胞，細胞懸液1：2接種至培養瓶，每3d更換培養基。（4）細胞提取后處理：定時在倒置相差顯微鏡下觀察兩種方法提取的原代干細胞及子代干細胞，并拍照記錄。（5）脂肪干細胞成脂誘導：子二代細胞長至亞融合狀態時，37℃下0.25%胰酶消化，離心棄上清液，基礎培養基重懸細胞，行細胞爬片，2d后更換誘導培養基，每3d更換誘導培養基。誘導后1周行油紅O染色。

2　結果

2.1從計時開始，傳統方法提取脂肪干細胞用時128min，新方法提取干細胞用時70min，新方法較傳統法縮短58min。

2.2傳統方法提取的3瓶原代ADSCs，1瓶污染（培養液混濁，見大量細菌生長），2瓶未見污染，污染百分比33.3%；改良法提取的5瓶原代ADSCs均未污染，污染百分比為0%。

2.3未污染原代ADSCs的生物特性 細胞接種4～6h后鏡下可見少量呈圓形或類圓形的細胞開始貼壁，24h后干細胞大多已貼壁，并開始伸展，多呈梭形，胞質中可見脂滴。48h后貼壁細胞開始分裂增殖，多呈成纖維細胞樣，細胞匯合成單層，排列出現方向性。

2.4脂肪干細胞培養及傳代情況 鏡下可見每瓶改良方法提取的原代脂肪干細胞數量均明顯多于每瓶傳統方法提取的原代脂肪干細胞數量，培養液中的雜質也是新方法中的較多，隨著換液和傳代，視野中的雜質逐漸減少。改良方法提取的原代干細胞3d后長至亞融合狀態，可傳代，而傳統方法提取的原代干細胞5d后方可傳代。兩種方法提取的細胞1：2傳代后增殖速度及生物特性上無明顯差別，均為傳代后4～6h開始貼壁，經過較短的潛伏期后開始增殖，約每3d傳一代。

2.5脂肪干細胞成脂誘導 對兩種方法提取的第二代脂肪干細胞進行成脂誘導，行油紅染色O染色后兩者均誘導成功，無明顯差別。

3　討論

在目前肝臟來源短缺的情況下，如何使受損肝臟再生從而恢復正常肝功能對晚期肝病患者十分重要。干細胞的獲取和培養是首先需要解決的問題。2001年Zuk等［1］首次從脂肪組織中提取并培養出ADSCs后，眾多的研究發現ADSCs具有和MSCs相似的生物學特性，在相應的誘導環境下可以向骨細胞、軟骨細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞、神經元細胞及肝細胞分化［4～12］，表現出成體干細胞的橫向分化能力。此外，ADSCs還具有取材方便、分布廣泛等MSCs所不具有的優點，因此ADSCs可以作為干細胞移植的首選種子細胞，有非常重要的研究和應用價值。

脂肪干細胞傳統提取方法步驟多，隨之帶來了提取時間長，容易污染，提取過程中細胞損失量多等諸多問題。在提取脂肪干細胞的過程中，膠原酶主要起到消化脂肪組織中的膠原組織，使細胞松散，便于干細胞脫落的作用。一定程度上提高膠原酶濃度，縮短消化時間，既可以顯著增加干細胞提取量，又可以減少操作時間，降低污染可能性，也不會出現干細胞生物學特性和分化能力的改變。此外，NH4Cl主要作用是裂解紅細胞，如果濃度或裂解時間控制不佳，會對干細胞造成損害，可能會影響干細胞提取的數量和干細胞的生物學特性及分化潛能；篩網濾過是物理性過程，主要目的是將細胞懸液中的一些比較大塊的組織碎片去除，過濾的過程必定伴隨著干細胞的損失和污染可能；脂肪干細胞提取過程中每增加一個步驟，就會增加一次細胞懸液離心過程，離心的過程也會造成細胞丟失和一定程度的損害。由此，將NH4Cl裂解紅細胞及篩網過濾懸液去除脂肪組織的步驟省去，這會造成視野不清晰，對干細胞的觀察不能達到十分理想的效果，但目前對原代脂肪干細胞生物學特性的了解已經十分深入，因此原代干細胞視野欠清并不會對實驗研究造成限制性影響。

本資料結果顯示，改良法提取脂肪干細胞能夠顯著的增加細胞提取數量，縮短提取時間，降低原代細胞污染率，且不會影響細胞生物學特性及分化能力，是一種簡單有效的脂肪干細胞提取方法。

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4 Zuk PA, Zhu M, Mizuno H.Multilineage cells from human adipose tissue：implications for cell-based therapies.Tissue Eng, 2001,7（2）：211～228.

5 Lee JH, Kemp DM.Human adipose-derived stem cells display myogenic potential and perturbed function in hypoxic conditions.Biochem Biophys Res Commun, 2006, 341（3）：882～888.

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·診治分析·

Objective Explore a simple and efficient extraction method of adipose-derived stem cell. Methods A comparison was made between an improved method and the conventional method, the former increased concentration of collagenase and saved the steps of erythrocyte lysis and fi ltration by screen on the basis of traditional method. Adipose-derived stem cells were respectively isolated by traditional method and improved method. Extration time and the quatity， biological characteristics and differentiation potential of adipose-derived stem cells were compared. Results the time for improved method was 70 minutes. There was no contamination in the fi ve cell bottles containing a lot of impurity. The time needed to passage was 3 days and the cells passaged grew well and were induced to adipocyte successfully. While the time for traditional method was 128 minutes. There was contamination in one cells bottle out of three bottles containing a little of impurity. The time needed to passage was 5 days and the cells passaged grew well and were induced to adipocyte successfully. Conclusion The modifi ed method can signifi cantly increase the quality of the extracted cells，shorten the extracting time and decrease the contamination rate of primary cells， while it would not affect the cell biological characteristics and the differentiation potential. So the method was simple and effective.

Adipose-derived stem cells Improved Extract

313300 浙江省安吉縣人民醫院（胡金靈 邵世飚）310028 浙江大學醫學院附屬第二醫院（梁廷波）