HIF—1α與VEGF在稽留流產(chǎn)組織中的表達(dá)及意義

李艷麗+楊麗麗+高晗+袁毅翀+朱發(fā)霞+顏彬+吳緒峰

[摘要] 目的 探討HIF-1α與VEGF在稽留流產(chǎn)及正常早期妊娠絨毛組織中的表達(dá)及意義。 方法 選擇早期妊娠（對(duì)照組）及稽留流產(chǎn)（實(shí)驗(yàn)組）患者各50例，用免疫組化SABC法分別檢測(cè)兩組患者絨毛組織中HIF-1α與VEGF的表達(dá)情況。 結(jié)果 HIF-1α在對(duì)照組中表達(dá)陽(yáng)性率為42%，在實(shí)驗(yàn)組表達(dá)陽(yáng)性率為76%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；VEGF在對(duì)照組中表達(dá)陽(yáng)性率為100%，在實(shí)驗(yàn)組表達(dá)陽(yáng)性率為66%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組中HIF-1α和VEGF的表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)關(guān)系（r=-0.298，P>0.05）；對(duì)照組中HIF-1α與VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.387，P<0.05）。 結(jié)論 HIF-1α及VEGF表達(dá)異?？赡芘c稽留流產(chǎn)發(fā)生有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 稽留流產(chǎn)；HIF-1α；VEGF

[中圖分類號(hào)] R714.43 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2014）35-0127-03

稽留流產(chǎn)是一種特殊類型的自然流產(chǎn)，指宮內(nèi)胚胎或胎兒死亡未及時(shí)排出者，早期者也稱胚胎停育。自然流產(chǎn)的發(fā)病率約為10%～15%?；袅鳟a(chǎn)的確切發(fā)病率不清楚，有報(bào)道稱約為流產(chǎn)人數(shù)的1%，且有逐年增高趨勢(shì)[1]?；袅鳟a(chǎn)的具體病因不明，常見(jiàn)的病因如染色體異常、激素水平異常、內(nèi)膜容受性低、解剖結(jié)構(gòu)異常、環(huán)境污染及特發(fā)性稽留流產(chǎn)等。這些病因?qū)е屡咛ネＶ拱l(fā)育的具體機(jī)制尚未闡明，目前也沒(méi)有系統(tǒng)的相關(guān)學(xué)說(shuō)。我們周圍的空氣中氧濃度約為21%，而大多數(shù)成人器官內(nèi)氧濃度僅2%～9%（生理性低氧），正常早期胚胎發(fā)育也是在低氧環(huán)境中完成的[2]?；袅鳟a(chǎn)的發(fā)生是否與胚胎不能適應(yīng)低氧環(huán)境相關(guān)，目前國(guó)內(nèi)外研究少有涉及。缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor 1-alpha，HIF-1α）是主要的氧濃度調(diào)節(jié)因子，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是強(qiáng)有力的血管生成因子，兩者均在許多生理及病理狀態(tài)中起作用。本研究通過(guò)檢測(cè)正常早期妊娠及稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中HIF-1α和VEGF的表達(dá)，探討稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中HIF-1α、VEGF的表達(dá)情況及其與稽留流產(chǎn)發(fā)生的關(guān)系，為稽留流產(chǎn)的發(fā)病機(jī)制研究提供新的思路。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇稽留流產(chǎn)患者50例為實(shí)驗(yàn)組，早孕自愿要求終止妊娠患者50例作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組患者年齡18～30 歲，平均 23.6歲，月經(jīng)周期規(guī)律，停經(jīng)45～60 d，平均50.6 d，經(jīng)臨床婦科檢查、血β-HCG、孕酮和B超檢查證實(shí)為宮內(nèi)妊娠且胚胎停止發(fā)育；對(duì)照組患者年齡19～33 歲，平均24.5歲，月經(jīng)周期規(guī)律，停經(jīng)42～57 d，平均48.1 d，自愿要求終止妊娠，B超提示宮內(nèi)妊娠，見(jiàn)心管搏動(dòng)。兩組患者的年齡、孕產(chǎn)次、停經(jīng)天數(shù)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 終止妊娠均采用吸宮術(shù)。術(shù)前行白帶常規(guī)、血常規(guī)、心電圖及婦科檢查均無(wú)明顯異常。在負(fù)壓下（負(fù)壓400～500 mmHg）行吸宮術(shù)采集絨毛組織，并將絨毛組織用生理鹽水漂洗干凈后置于10%中性福爾馬林溶液中固定，石蠟包埋，連續(xù)切片（厚5 μm），行免疫組化檢測(cè)。

1.2.2 免疫組化檢測(cè) 切片經(jīng)二甲苯、梯度酒精脫蠟至水，免疫組化采用SABC法，嚴(yán)格按試劑盒（武漢博士德公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，0.3%H2O2甲醇室溫孵育30 min，0.1M PBS沖洗5 min×3次，枸櫞酸鈉修復(fù)液微波抗原修復(fù)，PBS沖洗，5%正常羊血清37℃孵育30 min，傾去血清，分別滴加一抗HIF-1α與VEGF（武漢博士德公司，1：100），4℃冰箱過(guò)夜，PBS沖洗，分別滴加生物素化二抗（1：100）50 μL，37℃孵育30 min，PBS沖洗，滴加SA/HRP（1：100）50 μL，37℃孵育30 min，PBS沖洗，新鮮配制的DAB顯色5 min，清水沖洗，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，以已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.3 結(jié)果判定 ①HIF-1α和VEGF在絨毛組織中的表達(dá) HIF-1α主要表達(dá)于滋養(yǎng)細(xì)胞和合體滋養(yǎng)細(xì)胞的胞漿和間質(zhì)，少量表達(dá)于胞核。VEGF主要表達(dá)于滋養(yǎng)細(xì)胞和合體滋養(yǎng)細(xì)胞的胞漿和間質(zhì)，在胞核中無(wú)明顯表達(dá)。兩者陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)均于鏡下出現(xiàn)淡棕黃色、棕黃色、棕褐色顆粒。②結(jié)果判定[3] 綜合顯微鏡下陽(yáng)性細(xì)胞染色程度及陽(yáng)性細(xì)胞百分比來(lái)判斷。每張切片隨機(jī)取5個(gè)400倍高倍鏡視野，進(jìn)行染色強(qiáng)度計(jì)分和陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分。無(wú)明顯細(xì)胞著色為0分，著色呈淡棕黃色為1分，棕黃色2分，棕褐色3分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)、≤25%、26%～50%、51%～75%、>75%分別計(jì)0、1、2、3、4分。上述兩種計(jì)分結(jié)果相加，0～1分為陰性（-），2～3 分為弱陽(yáng)性（+），4～5 分為陽(yáng)性（++），6～7分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS12.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。HIF-1α與VEGF在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的相關(guān)性采用直線相關(guān)Pearson相關(guān)系數(shù)分析。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α在兩組患者絨毛組織中的表達(dá)

見(jiàn)表1。HIF-1α在對(duì)照組中表達(dá)陰性者29例，表達(dá)陽(yáng)性者21例，陽(yáng)性率42%；實(shí)驗(yàn)組表達(dá)陰性者12例，表達(dá)陽(yáng)性者38例，表達(dá)陽(yáng)性率76%。HIF-1α在實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)陽(yáng)性率高于對(duì)照組中陽(yáng)性率（χ2=5.974，P<0.05）。

2.2 VEGF在兩組患者絨毛組織中的表達(dá)

見(jiàn)表1。VEGF在對(duì)照組中表達(dá)陽(yáng)性率為100%；在實(shí)驗(yàn)組表達(dá)陰性者17例，表達(dá)陽(yáng)性者33例，表達(dá)陽(yáng)性率為66%。VEGF在實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)陽(yáng)性率低于對(duì)照組中陽(yáng)性率（χ2=9.647，P<0.05）。endprint

2.3 HIF-1α和VEGF在兩組患者絨毛組織中表達(dá)的差異

見(jiàn)圖1。HIF-1α在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)高于對(duì)照組中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.974，P<0.05）；而VEGF在實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)低于對(duì)照組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.647，P<0.05）。在對(duì)照組中，HIF-1α與VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.387，P<0.05）；在實(shí)驗(yàn)組中，HIF-1α和VEGF的表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)關(guān)系（r=-0.298，P>0.05）。HIF-1α在實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)高于對(duì)照組（χ2=5.974，P<0.05）；VEGF在實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)低于對(duì)照組（χ2=9.647，P<0.05）。在對(duì)照組中，HIF-1α與VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.387，P<0.05）；在實(shí)驗(yàn)組中，HIF-1α和VEGF的表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)關(guān)系（r=-0.298，P>0.05）。

3 討論

胚胎發(fā)育早期需要適應(yīng)宮腔內(nèi)相對(duì)低氧的環(huán)境。成功的妊娠依賴滋養(yǎng)細(xì)胞正確的胎兒胎盤(pán)血管生成，正確的血管生成才能為胚胎提供氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[4]，使其適應(yīng)低氧環(huán)境。若著床后絨毛血管生成不足，不能形成健康的血管網(wǎng)絡(luò)，則胚胎將不能如期發(fā)育而致妊娠丟失[5]。

血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）是一種由血管內(nèi)皮細(xì)胞、滋養(yǎng)細(xì)胞和炎性巨噬細(xì)胞等分泌且作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)其有絲分裂的細(xì)胞因子，被認(rèn)為是最強(qiáng)有力的血管生成因子。VEGF不僅能刺激血管生成，還能增加血管通透性及抗細(xì)胞凋亡[6]。早期妊娠時(shí)，伴隨著胚胎的著床與植入、胚胎與子宮內(nèi)膜之間血管的建立，VEGF大量產(chǎn)生[7]，在自然流產(chǎn)患者絨毛組織中VEGF表達(dá)則明顯下降[8]。本研究顯示，在正常妊娠絨毛組織（對(duì)照組）中，VEGF表達(dá)率100%，而在稽留流產(chǎn)組織中表達(dá)率僅66%，有明顯差異，與胡瑞華[9]等研究結(jié)果一致，說(shuō)明VEGF正常表達(dá)是正常妊娠必不可少的條件之一，而其表達(dá)下降將導(dǎo)致妊娠失敗。缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）是1992 年由Semenza等找到的一種氧依賴轉(zhuǎn)錄激活因子，其表達(dá)受多個(gè)途徑誘導(dǎo)，對(duì)氧濃度極為敏感，是氧感受家族中的管家轉(zhuǎn)錄因子，是缺氧應(yīng)答的全局性調(diào)控因子，為主要的氧濃度平衡調(diào)節(jié)因子[10]。低氧條件下，HIF-1α降解受抑制，能迅速合成和累積，從而調(diào)節(jié)其靶基因的轉(zhuǎn)錄[11]，在正常早期妊娠維持中起重要作用。HIF-1α促進(jìn)血管生成的下游靶基因及作用機(jī)制尚未完全明確。在成人造血干細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)HIF-1α的兩大靶基因之一為VEGF。有研究者對(duì)血管內(nèi)皮前體細(xì)胞中HIF-1α基因敲除的小鼠胚胎研究發(fā)現(xiàn)，基因敲除后血管前體細(xì)胞明顯減少，胚胎中血管生成明顯減少[12]。Yan Fang等研究表明[13]，正常早期妊娠人流絨毛組織中，HIF-1α表達(dá)增加，并通過(guò)Dll4/Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)增加VEGF表達(dá)；稽留流產(chǎn)絨毛組織中HIF-1α表達(dá)進(jìn)一步增高，但Dll4/Notch表達(dá)與HIF-1a-VEGF表達(dá)關(guān)系失衡，VEGF表達(dá)減少，這種調(diào)控機(jī)制被破壞可能是稽留流產(chǎn)發(fā)生的原因。HIF-1α在缺氧環(huán)境中的另一個(gè)作用是造成細(xì)胞凋亡[14，15]。RL95-2細(xì)胞系是研究子宮內(nèi)膜容受性的良好載體，Xu BF等[14]曾對(duì)RL95-2細(xì)胞系在低氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)研究，發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡率逐漸增加，HIF-1α表達(dá)率也逐漸增加，推測(cè)HIF-1α有致細(xì)胞凋亡作用而降低子宮內(nèi)膜容受性。本研究中，正常妊娠絨毛組織中HIF-1α表達(dá)率42%，而在稽留流產(chǎn)絨毛組織中表達(dá)率升高為76%，差異明顯；且對(duì)照組中，HIF-1α和VEGF表達(dá)呈正相關(guān)，說(shuō)明增高的HIF-1α上調(diào)VEGF表達(dá)，而實(shí)驗(yàn)組中HIF-1α和VEGF無(wú)明顯相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明稽留流產(chǎn)組織中HIF-1α表達(dá)雖進(jìn)一步增加，但未能上調(diào)VEGF的表達(dá)。推測(cè)可能在稽留流產(chǎn)組織中，缺氧更為嚴(yán)重，HIF-1α表達(dá)增加更明顯，但因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)被破壞，HIF-1α表達(dá)雖進(jìn)一步增加，并未能引起VEGF表達(dá)相應(yīng)增加，反而增加了細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致稽留流產(chǎn)發(fā)生[15]。

總之，健康的血管網(wǎng)絡(luò)的形成是成功妊娠的重要條件。而稽留流產(chǎn)絨毛組織中HIF-1α雖表達(dá)增加，但VEGF合成仍減少，血管網(wǎng)絡(luò)不能如期形成導(dǎo)致妊娠失敗。尚需要更多的研究來(lái)進(jìn)一步揭示稽留流產(chǎn)發(fā)生的機(jī)制。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 賈生蓮. 稽留流產(chǎn)64例臨床分析[J]. 內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2008，6：44.

[2] 邢傳平，劉斌，董亮，等. 免疫組織化學(xué)標(biāo)記結(jié)果的判斷方法[J]. 中華病理學(xué)雜志，2001，30（4）：318.

[3] Parisa Imanirad，Elaine Dzierzak. Hypoxia and HIFs in regulating the development of the hematopoietic system[J]. Blood Cells，Molecules and Diseases，2013，51：256-263.

[4] Rajakumar A，Conrad KP. Expression，ontogeny，and regulation of hypoxia-inducible transcription factors in the human placenta[J]. Biol Reprod，2000，63（2）：559-569.

[5] Torry RJ，Schwartz JS，Torry DS.Vascularization of placenta[M]. In： Tomanek RJ. Cardiovascular molecular morphogenesis：assembly of the vasculature and its regulation.New York，NY：Springer-Verlag，2002：239-273.endprint

[6] Ferrara N，Gerber HP，LeCouter J. The biology of VEGF and its receptors[J]. Nat Med，2003，9：669-676.

[7] Hefler L，Obermair A，Husslein P，et al. Vascular endothelial growth factor serum levels in pregnancy and preeclampsia[J]. Acta Obestet Gynecol Scand，2000，（1）：79-82.

[8] Chai L，Ling K，He X，et al. Expression of ATF4 and VEGF in chorionic villus tissue in early spontaneous abortion[J]. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2013，170（2）：434-438.

[9] 胡瑞華，李偉莉. 早期自然流產(chǎn)患者血清VEGF、sFlt-1水平的變化及意義[J]. 中醫(yī)藥臨床雜志，2012，24（7）：625.

[10] Anderson UD，Olsson MG，Kristensen KH，et al. Review：Biochemical markers to predict preeclampsia[J]. Placenta，2012，33（ Suppl）：s42-s47.

[11] Spencer K，Cowans NJ，Chefetz I，et al. Second-trimester uterine artery Doppler pulsatility index and maternal serum PP13 as markers of pre-eclampsia[J]. Prenat Diagn，2007，27（3）：258-263.

[12] G W Prager，E M Lackner，M T Krauth，et al. Targeting of VEGF dependent transendothelial migration of cancer cells by bevacizumab[J]. Mol Oncol，2010，4（2）：150-160.

[13] Yan Fang，Shuang Yu，Yuyan Ma，et al. Association of Dll4/Notch and HIF-1a-VEGF signaling in the angiogenesis of missed abortion[J]. Plos One，2013，8（8）：e70667.

[14] Xu BF，Sun XX，F(xiàn)eng Y，et al. Mechanism of hypoxia inducing factor-1α in low endometrial receptivity[J]. Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi，2011，46（5）：355-359.

[15] 王麗萍， 郭科軍. 缺氧誘導(dǎo)因子-1與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在子宮內(nèi)膜腺癌中的表達(dá)及與雌激素受體的相關(guān)性研究[J]. 臨床誤診誤治，2010，（8）：729-731.

（收稿日期：2014-10-28）endprint

[6] Ferrara N，Gerber HP，LeCouter J. The biology of VEGF and its receptors[J]. Nat Med，2003，9：669-676.

[7] Hefler L，Obermair A，Husslein P，et al. Vascular endothelial growth factor serum levels in pregnancy and preeclampsia[J]. Acta Obestet Gynecol Scand，2000，（1）：79-82.

[8] Chai L，Ling K，He X，et al. Expression of ATF4 and VEGF in chorionic villus tissue in early spontaneous abortion[J]. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2013，170（2）：434-438.

[9] 胡瑞華，李偉莉. 早期自然流產(chǎn)患者血清VEGF、sFlt-1水平的變化及意義[J]. 中醫(yī)藥臨床雜志，2012，24（7）：625.

[10] Anderson UD，Olsson MG，Kristensen KH，et al. Review：Biochemical markers to predict preeclampsia[J]. Placenta，2012，33（ Suppl）：s42-s47.

[11] Spencer K，Cowans NJ，Chefetz I，et al. Second-trimester uterine artery Doppler pulsatility index and maternal serum PP13 as markers of pre-eclampsia[J]. Prenat Diagn，2007，27（3）：258-263.

[12] G W Prager，E M Lackner，M T Krauth，et al. Targeting of VEGF dependent transendothelial migration of cancer cells by bevacizumab[J]. Mol Oncol，2010，4（2）：150-160.

[13] Yan Fang，Shuang Yu，Yuyan Ma，et al. Association of Dll4/Notch and HIF-1a-VEGF signaling in the angiogenesis of missed abortion[J]. Plos One，2013，8（8）：e70667.

[14] Xu BF，Sun XX，F(xiàn)eng Y，et al. Mechanism of hypoxia inducing factor-1α in low endometrial receptivity[J]. Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi，2011，46（5）：355-359.

[15] 王麗萍， 郭科軍. 缺氧誘導(dǎo)因子-1與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在子宮內(nèi)膜腺癌中的表達(dá)及與雌激素受體的相關(guān)性研究[J]. 臨床誤診誤治，2010，（8）：729-731.

（收稿日期：2014-10-28）endprint

[6] Ferrara N，Gerber HP，LeCouter J. The biology of VEGF and its receptors[J]. Nat Med，2003，9：669-676.

[7] Hefler L，Obermair A，Husslein P，et al. Vascular endothelial growth factor serum levels in pregnancy and preeclampsia[J]. Acta Obestet Gynecol Scand，2000，（1）：79-82.

[8] Chai L，Ling K，He X，et al. Expression of ATF4 and VEGF in chorionic villus tissue in early spontaneous abortion[J]. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2013，170（2）：434-438.

[9] 胡瑞華，李偉莉. 早期自然流產(chǎn)患者血清VEGF、sFlt-1水平的變化及意義[J]. 中醫(yī)藥臨床雜志，2012，24（7）：625.

[10] Anderson UD，Olsson MG，Kristensen KH，et al. Review：Biochemical markers to predict preeclampsia[J]. Placenta，2012，33（ Suppl）：s42-s47.

[11] Spencer K，Cowans NJ，Chefetz I，et al. Second-trimester uterine artery Doppler pulsatility index and maternal serum PP13 as markers of pre-eclampsia[J]. Prenat Diagn，2007，27（3）：258-263.

[12] G W Prager，E M Lackner，M T Krauth，et al. Targeting of VEGF dependent transendothelial migration of cancer cells by bevacizumab[J]. Mol Oncol，2010，4（2）：150-160.

[13] Yan Fang，Shuang Yu，Yuyan Ma，et al. Association of Dll4/Notch and HIF-1a-VEGF signaling in the angiogenesis of missed abortion[J]. Plos One，2013，8（8）：e70667.

[14] Xu BF，Sun XX，F(xiàn)eng Y，et al. Mechanism of hypoxia inducing factor-1α in low endometrial receptivity[J]. Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi，2011，46（5）：355-359.

[15] 王麗萍， 郭科軍. 缺氧誘導(dǎo)因子-1與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在子宮內(nèi)膜腺癌中的表達(dá)及與雌激素受體的相關(guān)性研究[J]. 臨床誤診誤治，2010，（8）：729-731.

（收稿日期：2014-10-28）endprint