環氧合酶-2在宮頸癌組織中的表達及對預后的影響

辛華棟 張莉華 田 芬 焦 茹 吳士茜 成艷梅

1.河北省邯鄲市第一醫院神經內科，河北邯鄲 056001；2.河北省邯鄲市中心醫院婦二科，河北邯鄲 056001；3.河北省邯鄲市中心醫院婦一科，河北邯鄲 056001；4.河北省邯鄲市中心醫院體檢中心，河北邯鄲 056001；5.河北省邯鄲市中心醫院病理科，河北邯鄲 056001

隨宮頸癌篩查技術的臨床推廣及應用，早期宮頸癌的治療滿意。 流行病學調查顯示：年輕宮頸癌的發病率近年呈增高趨勢。晚期及復發轉移宮頸癌仍面臨治療困難、生存質量差的棘手問題，約60%的復發轉移病例在2 年內死亡。而不良預后因素在臨床治療及病情監測方面發揮著重要的指導作用。在分子水平對惡性腫瘤的侵襲轉移及預后的研究成為近年腫瘤學研究的熱點領域。 COX-2 是花生四烯酸合成前列腺素的關鍵限速酶，在體內呈誘導型表達。 多項研究顯示，在鼻咽癌[1]、食道癌[2]、胃癌[3]、結直腸癌[4]、乳腺癌[5]、膀胱移行細胞癌[6]、非小細胞肺癌[7]等上皮惡性腫瘤中COX-2 蛋白或COX-2 mRNA 高表達，并與不良預后及生存率有關。 本研究旨在探討COX-2 與宮頸癌侵襲轉移的關系及對預后的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2008 年6 月～2009 年10 月在邯鄲市第一醫院及中心醫院住院治療的原發宮頸癌患者的蠟塊共95 例，臨床病理資料完整，排除合并其他惡性腫瘤及心腦血管疾病的患者，年齡27～80 歲，中位年齡42 歲。所有病理切片請兩位資深病理科醫師復核，按照國際婦產科聯盟（FIGO 2009）宮頸癌臨床分期標準[3]進行分期：Ⅰ期22 例，Ⅱ期43 例，Ⅲ期21 例，Ⅳ期9 例。 高、中、低分化（G1、G2、G3）分別為16 例、49 例及30 例。 鱗癌77 例，非鱗癌18 例（腺癌11 例，腺棘細胞癌5 例，小細胞未分化癌1 例，透明細胞癌1 例）。

1.2 實驗方法

采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶聯結免疫組化（S-P）法進行實驗檢測。 基本原理是采用生物素標記的第二抗體與鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過氧化物酶及基質素混合液來測定細胞和組織中的抗原。羊抗人COX-2 多克隆抗體、鼠抗人HPV16-E6 單克隆抗體。即用型羊S-P kate 檢測試劑、即用型鼠S-P kate檢測試劑；DAB 顯色試劑盒、S-P 試劑盒均為北京中山生物技術有限公司產品。 本實驗染色程序嚴格按S-P 染色試劑盒說明書操作。

1.3 免疫組化結果判斷

COX-2 陽性判定標準：細胞核內出現棕色或棕褐色顆粒為陽性表達。 根據文獻，按陽性細胞百分比及陽性細胞染色強弱評分（immunohistochemical scores，IHS）[8]：IHS=a×b。a 為陽性細胞百分比，每張切片隨機選擇5 個高倍視野計數陽性細胞100 個，放大倍數10×40：a=0，無陽性細胞；a=1，陽性細胞為1%～10%；a=2，陽性細胞＞10%～50%；a=3，陽性細胞＞50%～80%；a=4，陽性細胞＞80%。b 代表陽性細胞染色強弱：b=0，陰性；b=1，弱陽性；b=2，中度陽性；b=3，強陽性。HIS 為0 分者計為陰性，≥1 分者計為陽性。將以已知COX-2 陽性的肺癌切片作為陽性對照。

1.4 隨訪

通過電話、門診復查、書信等方式對患者進行隨訪，從確診之日起，至2014 年10 月隨訪結束。生存期以月為計算單位，隨訪時間為8.6～76 個月。 隨訪期內，95 例宮頸癌患者中死亡26 例，失訪3 例，其中9 例死于局部復發，8 例死于遠處轉移，7 例死于局部復發合并遠處轉移，1 例死于心肌梗死，1 例死于腦出血。 失訪者自失訪之日按截尾數據處理。

1.5 統計學方法

采用SPSS 21.0 軟件進行統計分析。 計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法。Pearson 法及Spearman 等級相關檢驗進行雙變量相關性分析，以Kaplan-Meier 法計算生存率并繪制生存曲線，組間生存率的比較采用Log-rank 檢驗，Cox 比例風險模型進行宮頸癌預后的多因素分析。 以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 COX-2 在宮頸癌中的表達情況

COX-2 的總陽性表達率為65.26%（62/95），見圖1～2（封三）。 其在年齡、組織學分級、臨床分期、腫瘤直徑及病理類型各組中比較差異無統計學意義（P ＞0.05），而在淋巴結轉移、宮旁或脈管浸潤及肌層浸潤深度各組中比較差異有統計學意義（P ＜0.05）。 相關分析顯示：COX-2 與腫瘤直徑、淋巴結轉移及宮旁或脈管浸潤呈正相關（r = 0.207、0.220、0.215，均P ＜0.05）。 見表1。

圖1 COX-2 在宮頸癌中的陰性表達（HE 染色，200×）

圖2 COX-2 在宮頸癌中的陽性表達（S-P 染色）

2.2 患者5 年生存率分析

95 例宮頸癌患者的5 年生存率為72.63%（69/95），生存時間最短8.6 個月，最長73 個月，中位生存時間54 個月。95 例宮頸癌患者的總生存曲線見圖3。

2.3 COX-2 對宮頸癌預后的單因素分析

COX-2 陽性患者的5 年生存率為61%，其中死亡23 例；COX-2 陰性患者的5 年生存率為91%，其中死亡3 例。 Log-rank 檢驗顯示：COX-2 陽性組的5 年生存率顯著低于陰性組（χ2=7.853，P ＜0.01），見表2。 生存曲線見圖4。

2.4 宮頸癌預后影響因素的多因素分析

將所有可能因素進行多因素分析結果顯示：COX-2、臨床分期、淋巴結轉移、腫瘤直徑及肌層浸潤深度對宮頸癌的預后均有影響差異統計學意義（P ＜0.05），是獨立預后因素（P≤0.05 為進入水準，P ＞0.1為剔除水準）。 而年齡、組織學分級、病理類型、宮旁或脈管浸潤對宮頸癌的預后無統計學意義（P ＞0.1）。見表3。

表1 COX-2 與宮頸癌臨床病理特征之間的關系（n = 95）

表2 宮頸癌預后的單因素分析結果（n = 95）

表3 宮頸癌預后影響因素的多因素分析

圖3 95 例宮頸癌患者的總5 年生存率

圖4 COX-2 表達情況的生存曲線

3 討論

COX-2 是完整的膜結合蛋白，在大多數正常組織中不表達或微量表達，但在炎癥細胞因子、生長因子、促癌劑、一氧化氮、缺氧、癌基因活化等刺激下，可于短期內上調20～40 倍，也被稱為即刻反應基因，與多種腫瘤的發生發展、侵襲轉移及不良預后有關。李媛媛等[9]對乳腺癌的研究中發現：免疫電鏡下COX-2 蛋白的膠體金顆粒定位于細胞的內質網及核膜上，這可解釋免疫組化染色為胞漿棕黃色著色。 內質網及核膜同屬于細胞內膜系統，COX-2 的定位提示：蛋白質的合成及轉運，即通過多種信號轉導通路及復雜的分子機制在腫瘤形成過程中可能發揮了重要作用，目前多項體內外實驗已做了初步探討[10-11]。

本研究中COX-2 陽性率在有淋巴結轉移、宮旁或脈管浸潤及深肌層浸潤組中的表達顯著低于無淋巴結轉移、宮旁或脈管浸潤及淺肌層浸潤組中，與前期研究一致[12]。相關分析顯示，COX-2 與淋巴結轉移、宮旁或脈管浸潤及腫瘤直徑呈正相關。 提示：在宮頸癌浸潤轉移過程中，COX-2 與淋巴結轉移、宮旁或脈管浸潤、肌層浸潤深度及腫瘤直徑密切相關。 局部直接浸潤和淋巴轉移是宮頸癌的主要轉移途徑，晚期出現血行轉移。 新生血管形成是腫瘤轉移的必要前提，實體瘤內微血管的數量及密度與腫瘤轉移的潛能呈正相關關系。 淋巴管多位于腫瘤間質內。 新生血管及淋巴管雜亂密集，基底膜連續性差，功能不完善，利于腫瘤細胞進入脈管系統，從而發生浸潤轉移。

一項直腸癌的研究顯示[13]，COX-2 與VEGF-C 表達呈線性關系，COX-2、VEGF-C 與微血管密度（MVD）及微淋巴管密度（MLVD）呈線性關系。 提示COX-2過表達可上調血管內皮生長因子C（VEGF-C）水平，進而誘導腫瘤組織中微血管及微淋巴管的生成，從而促進腫瘤的生長及轉移。 成旭惠等[14]在胃癌的研究中發現：COX-2 與VEGF（血管內皮生長因子）及MVD（微血管密度）呈正相關，VEGF 與COX-2 相互作用，誘導腫瘤新生血管生成，并與淋巴結轉移有關。 推測在宮頸癌中亦存在類似機制，促進腫瘤淋巴轉移、深部浸潤及遠處轉移。在宮頸癌侵襲的分子機制中，COX-2/前列腺素E2（PGE2）與MMP（基質金屬蛋白酶）相互上調，溶解細胞外基質、破壞細胞間連接。 其中MMP-9能降解包括基底膜Ⅳ型膠原在內的多種細胞外成分，使癌細胞向深層間質浸潤，亦可突破淋巴管及血管的基底膜形成脈管浸潤，增加腫瘤細胞侵襲性。 研究發現[15]，COX-2 通過NF-κB/Snail 信號通路下調E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達，致使細胞間粘附作用減弱。以上機制均可導致腫瘤上皮細胞間質化（EMT），細胞結構改變，極性喪失，與周圍細胞和基質的接觸減少，獲得間質細胞表型， 腫瘤細胞的遷移和運動能力增強，從而出現局部浸潤及遠處轉移。 COX-2 過表達可通過多種分子機制及多種信號轉導通路，增強宮頸癌細胞的侵襲性，使腫瘤細胞突破淋巴管及血管的脈管屏障，同時向間質深部浸潤，促進癌灶的局部直接浸潤及遠處轉移，與宮頸癌的不良預后有關。

本研究結果顯示，COX-2 在組織學分級和臨床分期各組中陽性率均無差異，提示COX-2 表達與分化程度及分期無關，相關分析結果亦證實以上結論。 但COX-2 與分化及分期進行統計學分析時，等級相關系數為負數，提示隨著分化程度降低及臨床期別的升高，COX-2 的表達有下降趨勢，但差異無統計學意義。即在宮頸癌Ⅰ、Ⅱ期及高分化病例中COX-2 已存在較高水平的表達，推測COX-2 表達上調是宮頸癌發生的早期事件。 這與張煥等[16]對非小細胞肺癌的研究結果相似。 前期研究顯示，在宮頸癌前病變時COX-2 的表達上調已有統計學意義，與HPV16-E6、E7 蛋白協同作用促使增生活躍的宮頸上皮細胞惡性轉化，突破基底膜，形成浸潤癌。 鄧星輝[17]等對胃癌的研究亦認為在不典型增生階段COX-2 高表達已存在，支持本研究結論。

本研究顯示，宮頸癌的總體5 年生存率為72.63%，隨臨床期別的增加，5 年生存率依次遞減，分別為84%、81%、55%及33%。 COX-2 表達陽性者5 年生存率為61%， 陰性者為91%， 經Log-rank 檢驗有顯著性差異。多因素分析COX-2 亦有統計學意義。提示COX-2 為宮頸癌預后的影響因素，與宮頸癌的不良預后密切相關。 袁冬蘭等[18]的研究結果與之相似。 國內外研究 報 導[4，7，19]：在卵巢癌、結直腸 癌 及非小 細 胞 肺 癌 中COX-2 均為不良預后的獨立預測因素， 并且在免疫組化水平和血清檢測中結果相似。本研究單因素分析顯示：除COX-2 外，淋巴結轉移、宮旁或脈管浸潤、腫瘤直徑、臨床分期及組織學分級均與宮頸癌預后密切相關。 結合臨床，進行多因素分析顯示，COX-2、淋巴結轉移、肌層浸潤深度、腫瘤直徑、臨床分期為宮頸癌的獨立預后因素。單因素分析中宮旁或脈管浸潤及分化程度的累積5 年生存率有顯著性差異，宮頸癌不良預后密切相關，但多因素分析中未進入COX 回歸模型的方程中。 而肌層浸潤深度的5 年生存率的Logrank 檢驗無統計學意義，但在P≤0.05 為進入水準的多因素分析中成為獨立預后因素。 分析原因，影響宮頸癌預后的因素多樣而復雜， 且通過多種分子機制、信號轉導通路增加癌細胞侵襲轉移潛能，各個因素在此過程中發揮權重不盡相同，還有待進一步深入研究其具體機制。 其二本研究入選病例有限，可能影響分析結果，期待大樣本的預后分析研究。

國內多認為臨床分期高、組織分化差及淋巴結陽性的病例預后差。 而國外文獻報道間質深浸潤、脈管浸潤以及盆腔淋巴結轉移是影響宮頸癌預后的3 大病理高危因素。 由此可見，淋巴結轉移是影響預后的重要因素。本研究數據顯示淋巴結陽性病例的死亡風險是陰性者的5.937 倍，COX-2 陽性的死亡風險是陰性者的3.723 倍，生存曲線可直觀反映COX-2 對宮頸癌不良預后的影響。 國外研究亦顯示，COX-2 高表達患者的5 年生存率顯著低于低表達者[20]。 國內研究顯示：COX-2 與淋巴結轉移、臨床分期及組織學分級有關[19，21]，并與腫瘤浸潤深度呈正相關[22]。COX-2 表達陽性者，其微淋巴管密度和微血管密度顯著高于陰性者[23]，一方面為腫瘤病灶的生長提供營養，一方面通過促進基質金屬蛋白酶及CD44 活化，下調E-cadherin蛋白，增加腫瘤細胞的侵襲力。宮頸腫瘤直徑越大，分化越差，期別越晚，COX-2 陽性表達率高，在分子機制水平發揮作用，致使通過宮旁新生毛細血管及淋巴管浸潤轉移的概論越高，出現深肌層浸潤、脈管瘤栓及淋巴結轉移的概論越高，從而影響患者的預后。

綜上所述，COX-2 與宮頸癌的淋巴結轉移、宮旁或脈管浸潤、肌層浸潤深度及腫瘤直徑密切相關，在侵襲、演進及遠處轉移等惡性生物學行為中發揮了重要的作用，且是宮頸癌不良預后的獨立預測因素，可作為預后監測的指標之一。 臨床需重視淋巴結轉移、宮旁浸潤、脈管瘤栓、深肌層浸潤、腫瘤病灶大、分期晚、分化差等高危因素的病例，結合COX-2 的檢測，對評估預后及指導治療具有重要的臨床價值。近年研究發現COX-2 抑制劑能使多種腫瘤細胞如宮頸癌Hela細胞系體外增殖受限。 有研究顯示[24]，COX-2 抑制劑塞來昔布，已進行Ⅲ期臨床試驗，以減少結腸癌的發生。 COX-2 抑制劑作為宮頸癌放化療的增敏劑，有學者已進行了初步探討。 筆者推測COX-2 作為宮頸癌的靶點治療將發揮積極的作用，期待COX-2 抑制劑臨床實驗的推廣，本研究為此提供了理論基礎及實驗依據。

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