Lenti-Toll樣受體4-siRNA的構建及對大鼠肺泡巨噬細胞NR8383的影響

張小藝 孟紅艷 彭 敏 司 皓 馬宏博

1.山東大學附屬省立醫院中醫科，山東濟南 250021；2.山東大學公共衛生學院，山東濟南 250012

內毒素（lipopolysaccharide，LPS）是導致急性肺損傷（acute lung injury，ALI）的重要因素，Toll 樣受體（Toll like receptor，TLR）是LPS 信號向細胞內傳導的“門戶蛋白”[1]， 其信號通路的過度激活是導致炎性反應爆發失控的重要機制。 TLR4 可以選擇性識別LPS，LPS 與單核巨噬細胞、中性粒細胞等免疫細胞細胞膜上的TLR4 結合，引起炎癥瀑布效應[2]。 調節TLR4 信號通路有可能成為膿毒癥的一種治療策略[3]。

RNA 干擾（RNA interference，RNAi）近年來取得相當大的進展，研究人員利用RNAi 作為研究工具引入到細胞或整個生物RNAi 試劑，用以識別新的細胞通路和潛在的藥物靶點[4]。 慢病毒載體是一種高效率的轉基因和基因治療工具，其最大優勢在于能夠感染分裂和靜止狀態下的細胞，并且能夠高效、穩定地整合于宿主細胞內[5]。 本實驗通過構建TLR4 siRNA 慢病毒載體，轉染至大鼠巨噬細胞NR8383，并通過實時定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測TLR4 siRNA 干擾的效果，為進一步探討TLR4 信號通路在ALI 發生、發展中的機制提供研究工具。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

聚合酶鏈反應（PCR）反應試劑，Primer（R＆F）合成、dsDNA oligo、293T 細胞株、大腸埃希菌菌株DH5α、病毒載體均由上海吉凱基因化學技術有限公司提供；Taq 酶、SYBR Master Mixture 購于TaKaRa；Age Ⅰ、EcoRⅠ、T4 DNA ligase、T4 DNA ligase buffer 來 自 于NEB；QIAGEN Plasmid 大抽Kit 來自QIAGEN；Rnase Inhibitor、dNTP、M-MLV 逆轉錄酶購于Promega；Lipofectamine 2000、Trizol 購 自Invitrogen；ECL-PLUS/Kit購于Amersham 公司；positive clone 測序由上海美季生物技術有限公司完成；胎牛血清、DMEM 購自Gibco公司；Opti-MEM 購自Invitrogen。

1.2 方法

1.2.1 TLR4 基因RNAi 慢病毒載體構建

1.2.1.1 siRNA 靶點設計 針對TLR4 目的基因靶基因序列，采用Invitrogen 軟件（https：//rnaidesigner.invitrogen.com/sirna/）設計4 個RNA 干擾靶點序列。見表1。

表1 TLR4 siRNA 靶點設計

1.2.1.2 RNAi 慢病毒載體構建 工具載體選擇GV115，框架結構為hU6-MCS-CMV-EGFP，酶切位點：Age Ⅰ，EcoR Ⅰ。 合成含干擾序列的DNA oligo，經退火形成雙鏈DNA，與經Age Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切后的載體連接。 見表2。

表2 RNAi 合成片段

1.2.1.3 克隆制備與鑒定 通過T4 DNA ligase 將酶切回收的載體和DNA 片段進行鏈接反應， 將鏈接產物轉入制備好的DH5α 細菌感受態細胞，挑取轉化子重懸于10 μL LB 溶液，使用GV115 通用引物，進行菌落PCR 鑒定實驗。 將PCR 陽性克隆進行測序，經結果比對，確認測序引物與鑒定引物中的上游引物相同即為構建成功的TLR4 目的基因RNAi 慢病毒載體。測序結果通過Chromas 軟件進行分析。PCR 鑒定陽性克隆的引物為：上游5′-CCATGATTCCTTCATATTTGC-3′，下游5′-CGCGTGGATAACCGTATTAC-3′。 PCR 鑒定的分組為1：陰性對照（ddH2O）；2：陰性對照（空載）；3：Marker 自上而下依次為5 kb、3 kb、2 kb、1.5 kb、1 kb、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp；4：TLR4-RNAi 轉化子（a：Tgt-1；b：Tgt-2；c：Tgt-3；d：Tgt-4）。

1.2.2 RNAi 慢病毒小量包裝

制備編碼慢病毒顆粒的重組病毒質粒及其兩種輔助包裝原件載體質粒，分別進行高純度無內毒素抽提， 在Lipofectamine 2000 介導下共轉染293T 細胞，培養8 h 后倒去含有轉染混合物的培養基， 加入含10%血清的細胞培養基，繼續培養48 h，收集293T 細胞上清液，過濾離心后取病毒濃縮液，分裝后保存在病毒管中，－80℃保存，取1 支以熒光法進行病毒生物學滴度測定。

1.2.3 慢病毒感染細胞

1.2.3.1 細胞培養 實驗細胞大鼠肺巨噬細胞株NR8383購自ATCC 公司，培養于含15%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）、鏈霉素（100 μg/mL）、L-谷氨酰胺（2 mmo/L）、NaHCO3（1.5 g/L）的Ham′s F12 培養基中，細胞在37℃、5%CO2條件下培養，在對數生長期進行實驗。

1.2.3.2 NR8383 細胞慢病毒感染 將處于對數生長期的大鼠肺泡巨噬細胞NR8383 進行胰酶消化，制成細胞懸液，接種于6-well 培養板培養，待細胞融合度達到約30%， 按設計組別分別加入慢病毒顆粒進行NR8383 細胞的感染實驗，12 h 后觀察細胞狀態，如無明顯細胞毒性，連續培養24 h 后更換培養基。 感染3 d 后熒光顯微鏡下觀察GFP 表達，熒光率達80%以上，收集細胞，感染效率低于80%的實驗組，重新進行感染實驗。 見表3。

表3 細胞感染實驗分組和病毒用量

1.2.4 qPCR 內源篩靶

收集生長狀態良好的目的細胞， 提取RNA，總RNA 抽提根據Trizol 操作說明書進行。 RNA 逆轉錄獲得cDNA，按照M-MLV 操作說明書進行，采用RTPCR 檢測目的基因的表達情況。TLR4 上游引物序列：5′-ATGAGGACTGGGTGAGAAACG-3′，下游引物序列：5′-ATGCCAGAGCGGCTACTCA-3′， 擴增長度：247 bp；內參GAPDH 上游引物序列：5′-TTCAACGGCACAGTCAAGG-3′，下游引物序列：5′-CTCAGCACCAGCATCACC-3′，擴增長度：114 bp。 用TP800 序列檢測系統軟件（TaKaRa 公司）制作擴增曲線并進行數據分析，依據2-ΔΔCt數據分析法，比較各組TLR4 基因mRNA 表達水平。

1.2.5 有效靶點慢病毒大量包裝及驗證內源性目的基因表達敲減

根據RT-PCR 結果，篩選出敲減效率最高的1 個RNAi 有效靶點，進行慢病毒大量包裝。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0 統計軟件對數據進行分析和處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗，以P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 陽性克隆的PCR 鑒定

載體上的引物進行PCR 鑒定陽性克隆， 經瓊脂糖凝膠電泳檢測其大小和完整性，每個序列陽性克隆各取3 個樣品菌種送上海美季公司測序， 結果通過Chromas 軟件進行分析。 鑒定電泳結果顯示，TLR4 vshRNA 片段已經成功插入質粒，挑選的陽性克隆菌液測序結果與實驗要求的DNA 序列完全一致。 見圖1。

2.2 慢病毒滴度測定

圖1 陽性克隆的PCR 鑒定

測定前1 d 為293T 細胞鋪板， 每孔加4×104個細胞，在Eppendorf 管中加入90 μL 無血清培養基，將10 μL 病毒原液加入到第1 個管中， 混勻后取10 μL加入到第2 個管中， 如此分別稀釋為1/10～1/100 萬，感染293T 細胞，24 h 后加入完全培養基100 μL，4 d后，觀察綠色熒光蛋白表達，通過GFP 陽性細胞計數法測定LV-TLR4-RNAi（Tgt-1、2、3、4）的滴度分別為5×108、4×108、4×108、5×108TU/mL。

2.3 慢病毒感染細胞

感染后16 h 更換培養基，感染后96 h 熒光拍照。圖2 顯示各組慢病毒成功感染NR8383 細胞。

圖2 熒光顯微鏡下慢病毒感染NR8383 細胞GFP的表達（100×）

2.4 RT-PCR 內源篩靶

RT-PCR 檢測結果顯示，NR8383 細胞中，相對于陰性對照組，KD2 組TLR4 基因敲減效率達到65%（P ＜0.05）（圖3，封三），認為是KD2 有效靶點。

圖3 RT-PCR 檢測TLR4 mRNA 的表達

2.5 病毒大量包裝后的靶點再次驗證

根據RT-PCR 篩選結果，選取敲減效率最高的KD2 號靶點進行病毒的大量包裝后， 經定量PCR 測定，在NR8383 細胞中，相對于NC、KD2 組TLR4 基因敲減效率達到90.1%（P ＜0.05）。

3 討論

ALI 發病的關鍵是一種肺內過度性、失控性的炎性反應， 多種炎癥細胞和炎癥介質相互的激活與釋放，導致瀑布式的炎性反應，形成肺的過度損傷[6-7]。研究表明，ALI 患者TLR4 的表達水平與急性肺部炎癥程度及氣道上皮細胞的損傷、肺部中性粒細胞增加相關[8]。TLR4 可以早期識別侵入體內的細菌啟動炎性反應，核因子（NF）-κB、激活蛋白-1（AP-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）等的激活均為其下游事件， 最終導致多種炎性因子的瀑布式釋放，放大炎癥效應[9]。 研究證實，TLR4 基因缺陷小鼠對內毒素的敏感性明顯下降，肺組織病理損傷和肺水腫程度減輕[10]，以TLR4 基因為靶點，從上游調控這種瀑布式的炎癥效應，可為治療急性感染性疾病提供一種新的策略[11]。

RNAi 技術是近年來發現的一種重要的基因沉默技術，RNAi 能夠非常特異地降解與之序列相應單個內源基因mRNA， 相對少量的dsRNA 就可以使表型達到缺失突變體程度，抑制基因表達效率很高[12-14]，已成為研究信號傳導通路的良好工具。 RNAi 技術在調節免疫系統增強免疫反應、控制炎癥和治療自身免疫性疾病中都發揮了作用[15]。

RNAi 的沉默效應與基因的轉染效率密切相關[16]。基因轉染的方法可分為病毒轉染和非病毒轉染，常用的病毒載體包括逆轉錄病毒、慢病毒、腺病毒和腺相關病毒載體[17]。 慢病毒載體是以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒（HIV-1）為基礎發展起來的基因治療載體，可感染分裂細胞及非分裂細胞， 轉移基因片段容量較大，目的基因表達時間較長，還可整合到宿主細胞的染色體基因組上，不易引發宿主免疫反應[18-20]，已成為基因功能研究及基因治療領域中熱門的基因轉移載體[21]。

本研究成功構建了4 個TLR4 基因RNAi 慢病毒表達載體， 具有較高滴度，4 種慢病毒載體感染大鼠肺巨噬細胞NR8383 后，TLR4 基因mRNA 表達量均明顯下降，其中LV-TLR4-RNAi（Tgt-2）抑制作用最明顯，使mRNA 表達下降65%，將2 號靶點進行病毒的大量包裝后，TLR4 基因敲減效率達到90.1%，表明本研究構建的慢病毒RNAi 表達載體在NR8383 細胞內能有效地沉默TLR4 基因表達， 為后續研究TLR4信號通路在ALI 發病過程中的作用及中藥干預的靶點奠定了基礎。

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