微柱凝膠法檢測孕婦血清IgG抗體效價參考值的臨床研究

羅國勝 朱彩云 席雅娟 魏玉娥 吳湘蘭 馮春顏 李凌波

1.廣東省深圳市龍華新區人民醫院檢驗科，廣東深圳 518109；2.廣東省深圳市龍華新區人民醫院新生兒科，廣東深圳 518109；3.長春博迅生物技術有限責任公司研發部，吉林長春 130012

新生兒溶血病（hemolytic disease of the newborn，HDN）是由于經胎盤傳播的母體免疫球蛋白（Ig）G 抗體與胎兒紅細胞上不同于母體（即遺傳自父系）的抗原結合，結果導致胎兒和/或新生兒紅細胞壽命縮短的一種疾病[1]。 臨床因母嬰ABO 血型不合引起的HDN最為常見，IgG 是唯一能通過胎盤進入胎兒血液循環的抗體，該抗體進入胎兒血液循環后破壞胎兒紅細胞而致新生兒ABO 溶血病（ABO-HDN），可出現胎兒黃疸、貧血、水腫、流產、早產，嚴重者將造成新生兒生理缺陷甚至死亡。由于ABO-HDN 的發病程度與母體內IgG 抗A（B）的效價有一定相關性[2-3]，因此可通過定期檢測孕婦體內IgG 抗A（B）的效價來判斷胎兒受累情況，并根據IgG 抗體水平及早采取相應的防治措施，這對優生優育、提高人口素質具有重要意義。本研究采用國產微柱凝膠試驗技術對夫婦ABO 血型不合的3038 例O 型孕婦檢測其血清IgG 抗A（B）效價，并分析其與209 例產后臨床診斷為ABO-HDN 新生兒的關系。 現將研究結果報道如下：

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2011 年10 月～2013 年12 月在廣東省深圳市龍華新區人民醫院（以下簡稱“我院”）產科門診就診的夫婦ABO 血型不合O 型孕婦3038 例，夫婦血型為A-O 型的1355 例，B-O 型1209 例，AB-O 型474 例。孕婦年齡17～44 歲，平均（27.6±1.1）歲，孕16～40 周，上述所有孕婦均無輸血史。 孕婦Rh（D）血型陰性9 例，其余均為陽性，除1 例血清不規則抗體篩查為陽性（后經鑒定為IgG 抗D 且效價＜2）外，其余均為陰性，故本研究不考慮ABO 血型系統以外IgG 抗體的效價。 上述O 型血孕婦所分娩的新生兒209 例，均以黃疸或進行性黃疸加重為主要癥狀，出生72 h 后總血清膽紅素水平均≥257 μmol/L（15 mg/dL），臨床診斷ABO-HDN 依據文獻[4-5]。

1.2 試劑和儀器

0.2 mol/L 2-ME 應用液、0.8%ABO 血型反定型試劑盒（人血紅細胞）、ABO、RhD 血型定型檢測卡（單克隆抗體）、抗人球蛋白檢測卡（不規則抗體篩檢）、HDN母體IgG 抗體效價檢測卡均由長春博迅生物技術有限責任公司提供；不規則抗體檢測試劑（人紅細胞）由長春博德生物技術有限責任公司提供。以上所有試劑均在效期內使用。FYQ 型免疫微柱孵育器、TD-3A 型血型血清學用離心機（長春博研科學生物儀器有限公司）、DK-600 型電熱恒溫水槽（上海申賢恒溫設備廠）。

1.3 檢測方法

1.3.1 母體血清不規則抗體篩檢 采用抗人球蛋白檢測卡（不規則抗體篩檢）進行不規則抗體篩查，按廠家使用說明書進行操作和判讀。

1.3.2 母體IgG 抗A（B）抗體效價檢測 400 μL 血清標本與0.2 mol/L 2-ME 應用液400 μL 充分混勻，封口膜封緊試管口，37℃60 min， 充分裂解血清中IgM類抗體。 標記兩組10 mm×60 mm 的試管各12 個，第12 管為陰性對照（生理鹽水）， 吸經2-ME 處理后血清用生理鹽水做倍比稀釋，稀釋度分別為1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024、1∶2048，用鹽水法確定1∶2 稀釋度管IgM 抗體已被破壞[6-7]。 以HDN 母體IgG 抗體效價檢測卡檢測IgG 抗A（B）血型抗體效價，取檢測卡做好標記，在微管內各加入50 μL與孕婦丈夫同型的0.8%標準紅細胞懸液（測定孕婦ABO 系統IgG 血型抗體），再依次加入處理過的稀釋度為1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024、1∶2048 的血清及陰性對照（生理鹽水）各50 μL，37℃孵育15 min，專用離心機離心5 min（900 r/min，2 min；1500 r/min，3 min）。 以出現1+凝集強度的血清最高稀釋度為陽性判斷標準，并以此血清稀釋度的倒數為效價[6]。

1.3.3 O 型血孕婦所分娩的新生兒血清學檢測 對新生兒進行HDN 血型血清學三項試驗（包括直接抗人球蛋白試驗、游離抗體試驗、抗體放散試驗，分別簡稱“直抗試驗”、“游離試驗”、“放散試驗”）均采用微柱凝膠技術。 具體方法參照文獻[3]。

1.3.4 通過新生兒溶血病3 項試驗判斷ABO-HDN 直抗試驗以出現凝集為陽性，游離和放散試驗以檢出可以和新生兒紅細胞反應的抗體為陽性，單項放散試驗陽性及其他項目陽性同時合并放散試驗陽性的結果均可判為ABO-HDN，直抗及游離試驗1 項陽性只能判定為ABO-HDN 可疑陽性，兩者同時陽性可判為ABO-HDN[8]。

2 結果

2.1 O 型孕婦IgG 抗A（B）效價分布

3038 例O 型孕婦中，IgG 抗體效價≥256（異常例數）者1388 例，占45.69%。 其中，夫婦為A-O 型的異常例數有681 例，占總例數（1355 例）的50.26%，夫婦B-O 型的異常例數有507 例，占總例數（1209 例）的41.94%，夫婦AB-O 型的異常例數有200 例，占總例數（474 例）的42.19%。 見表1。

2.2 臨床診斷為ABO-HDN 的新生兒血清學三項試驗結果

臨床診斷為ABO-HDN 的新生兒血清學三項試驗結果顯示，209 例患者均為放散試驗陽性，其次游離試驗陽性率也高達86.12%，而游離+放散+直抗實驗陽性率為32.54%。 見表2。

表1 O 型孕婦IgG 抗A（B）效價分布[n（%）]

表2 臨床診斷ABO-HDN 新生兒血清學三項試驗結果

2.3 臨床診斷為ABO-HDN 的新生兒母體IgG 抗體效價分布

209 例中效價≥256 的有206 例，另有3 例合并有紅細胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-PD 酶）缺乏新生兒的母體IgG 抗體效價均為128。 見表3。

表3 臨床診斷ABO-HDN 新生兒母體IgG 抗體效價分布

3 討論

母嬰血型不合可以引起HDN，溶血結果可致胎兒及新生兒貧血及發生顯著的新生兒黃疸，嚴重黃疸引起的高膽紅素血癥是該病的常見并發癥之一。早期嚴重的高膽紅素血癥可能引起核黃疸，從而留下聽力喪失、腦性癱瘓、智力發育障礙等后遺癥，給社會及家庭帶來沉重負擔。與HDN 相關的血型抗原超過50 種以上，其中以ABO-HDN 最為常見，但大多數ABO-HDN 癥狀較輕，通常可表現為產后24 h 內出現輕微黃疸，但由于特定族群中二磷酸尿苷葡萄糖醛基轉移酶基因啟動子變異導致了亞洲部分國家高膽紅素血癥的高發[7]。

導致新生兒膽紅素升高的原因有多種，如ABO及Rh 溶血癥、G-6-PD 缺陷癥、早產因素、敗血癥等。近年來有研究指出，我國核黃疸的發生率高于西方國家，且高膽紅素血癥導致核黃疸的新生患兒中伴發ABO 溶血的概率為29.9%[9]，可見母嬰ABO 血型不合溶血病是膽紅素升高的主要病因。 另據報道，我國ABO-HDN 約占新生兒溶血病的85.3%[5]，ABO-HDN治療的重點是降低血清膽紅素，防止核黃疸的發生[4]。一般認為，在產前通過測定孕婦血清中的免疫性抗體效價是預測母嬰血型不合溶血病發生及程度的重要依據之一[2-3]，本研究顯示，采用國產微柱凝膠試驗技術對夫婦ABO 血型不合的3038 例O 型孕婦產前檢測其血清IgG 抗A（B）效價，效價≥256 的為1388 例，占45.69%，與姚文娟等[10]的研究結果48.60%相接近。產后臨床診斷為ABO-HDN 的209 例新生兒均為上述1388 例中的孕婦所分娩。 對此209 例新生兒出生后監測其血清膽紅素并及時做HDN 三項試驗， 本研究結果表明，209 例全部放散試驗陽性，放散合并游離試驗陽性的113 例，放散合并直抗+游離試驗陽性的為63 例，可見免疫試驗結果支持了臨床診斷，放散試驗可作為確診ABO-HDN 的重要依據，以便對ABO-HDN 及早發現和治療，保護新生兒健康。

研究表明，ABO-HDN 發病風險與母血清IgG 抗A（B）效價有一定相關性，隨其水平的升高而遞增[11-12]。一般認為，以試管法檢測孕婦IgG 抗A（B）效價達到64 時[2-3]，則有發病的可能，如果其水平持續性升高，應及時采取臨床干預措施。 以往常用于產前孕婦IgG血型抗體效價檢測的方法主要是試管抗人球蛋白試驗，用該法測得孕婦IgG 抗體效價為64 時，即是預防ABO-HDN 有臨床意義的參考值。 微柱凝膠法以其較高的靈敏度、更簡便的操作，目前已逐步取代傳統的試管法應用于ABO-HDN 的產前檢測[6，11]，鑒于微柱凝膠技術用于產前IgG 抗體效價檢測比試管法具有更高的靈敏度，研究認為各實驗室應在試驗基礎上確立微柱凝膠技術相應的參考值[2，7，13]，以避免靈敏度過高對正確分析病情造成干擾。對微柱凝膠技術參考值的確定，已有的研究報道觀點不盡相同，有學者認為與傳統試管抗人球蛋白法差別不大，即以效價64 為參考值[14-15]；另有學者則認為應將效價設在128 左右[13，16]；還有學者認為應設在256 附近[17-18]。 本研究顯示，產后檢測確診的209 例ABO-HDN 患兒母體血清IgG 抗體效價，除3 例合并有G-6-PD 酶缺乏新生兒的母體抗體效價為128 外，其余的206 例抗體效價均≥256，考慮G-6-PD 缺乏是由于紅細胞不能激活戊糖磷酸的代謝途徑，并降低抗氧化能力，從而伴發高膽紅素血癥。 綜合上述結果，筆者提出應用國產微柱凝膠技術產前檢測ABO-HDN 母體IgG 抗體效價以256 作為參考值是恰當的，而正常參考范圍為＜256 較為合理。 當然，各實驗室在將不同的微柱凝膠卡用于母體抗體效價檢測時，不同的操作程序及人員，也會導致其參考值出現差異。 因此，有必要根據試驗建立各實驗室的臨床參考值，根據各自科室的情況設立標準，并把相關信息通知產科或新生兒科醫生。

當前，臨床實驗室常用于檢測母體IgG 類抗體的方法是傳統的試管法抗人球蛋白試驗[6]。 1945 年，科學家Coombs 發明制備了抗IgG 類抗體的抗人免疫球蛋白抗體，以此搭橋使鹽水介質中的相應IgG 抗體和紅細胞發生肉眼可見的凝集反應。 該技術也被稱之Coombs 實驗，由此發現了很多新生兒溶血性疾病和輸血反應是IgG 類抗體所致，而應用傳統的鹽水血凝試驗無法檢測。 半個多世紀以來，Coombs 試驗始終是最經典、 最準確檢測不完全抗體（主要是IgG 類） 的方法。但由于傳統試管法Coombs 試驗方法復雜，孵育時間長等原因，不適用于大批量樣本的檢測。 1990 年，Lapierre 等[19]報道了檢測紅細胞抗原抗體反應的一種新方法—微柱凝膠試驗。 至今，在一些國家該方法已成為輸血相容性及HDN 相關抗體檢測的一種常規方法[20-21]。 微柱凝膠免疫檢測新技術是將抗原抗體反應與凝膠分子篩技術相結合，即微柱凝膠免疫實驗。 該技術的本質是血凝試驗，即紅細胞抗原抗體在微柱腔內的凝膠介質中發生肉眼可見的免疫凝集反應。微柱凝膠Coombs 試驗孵育后的紅細胞不需三洗，且該法孵育時間只需15 min，具有操作簡便、影響因素少、結果可保存等優點，尤其提高了免疫凝集試驗的敏感性，使其能更廣泛地應用在HDN 相關的母體IgG 類抗體檢測中[13]。 本研究顯示，確診的209 例ABO-HDN 中，206 例其患兒母血清IgG 抗體效價均達到或超過256，也說明了應用微柱凝膠技術進行產前效價的檢測確能對HDN 的發生發展趨勢做出一定的預判， 微柱凝膠法檢測孕婦IgG 血型抗體效價可作為評估HDN發生風險的指標之一[22]。

同時，本文檢測結果表明，IgG 抗體效價≥256（異常例數）的有1388 例，但確診的僅206 例，約85%的新生兒并未發病。 由此也表明，IgG 血型抗體效價并非判斷HDN 嚴重程度的唯一性指標，HDN 的嚴重程度可能與很多因素有關，如母體抗體的IgG 亞型和糖基化、血型抗原的結構、位點密度、發育成熟程度及在其他組織中的分布、IgG 抗體經胎盤轉運的速率、胎兒脾臟功能成熟度、Fc 受體功能多態性的影響、人類白細胞抗原相關抑制抗體的影響等[7]。 因此有研究認為，對于產前檢測效價持續升高者，還應結合其他檢測項目，如羊水、B 超檢查等及孕婦臨床狀況綜合分析，做出判斷[12]。

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