UPLC-MS/MS法同時測定金水寶膠囊中5種成分的含量

雍太萍 華云鵬 宗寧峰 畢 慧 陸 瑜

解放軍第四五四醫院藥學部，江蘇南京 210002

金水寶膠囊主要成分是冬蟲夏草分離純化的蟲草菌-蝙蝠蛾擬青霉CS-4 菌株， 經人工發酵培養加工而成[1-4]。該藥具有補腎養肺、固精益氣、增強免疫力之功效[5-10]。 臨床上廣泛用于治療肺腎兩虛、精氣不足所致的咳嗽多喘、全身無力、失眠多忘、月經不調、腰膝酸軟等[11-18]。

本研究旨在建立一種選擇性好、快速簡便的超高效液相色譜串聯質譜（UPLC-MS/MS）法同時測定金水寶膠囊中5 種成分的質量濃度， 為控制金水寶膠囊的質量提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 藥品與試劑

金水寶膠囊（江西濟民可信金水寶制藥有限公司，批號：150422、150515、150616）；標準品：腺苷（成都普瑞法科技開發有限公司，批號：13081813，純度：99.2%）、胞苷（成都普瑞法科技開發有限公司，批號：13062509，純度：98.9%）、鳥苷（成都普瑞法科技開發有限公司，批號：13091006，純度：99.3%）、甘露醇（成都普瑞法科技開發有限公司，批號：13110812，純度：99.5%）、腺嘌呤（成都普瑞法科技開發有限公司，批號：13120812，純度：99.2%）。 其他相關試劑均為色譜純。

1.2 儀器

Agilent 1290 超高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；Agilent G6430 質 譜 儀，MassHunter 色 譜 工 作 站（美國Agilent 公司）；Precisa XS225A 十萬分之一分析天平；AnkeTDL-40B 離心機（上海科學安瓶科學儀器制造廠）； 渦旋混合器ZH-2 （天津藥典標準儀器廠）；Drict-Q5 超純水機（法國Millipore 公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜及質譜條件

流動相：甲醇-0.1%甲酸水溶液（5∶95，V/V）；色譜柱：Agilent ZOBAX SB C18（2.1 mm×150 mm，5 μm）；流速：200 μL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：2 μL。 采取自動進樣方式。 離子化模式：正離子；定量模式：多反應監測模式（MRM）；毛細管電壓：4000 V；干燥氣溫度：400℃；腺苷的Fragmentor 及CE 值分別為100、20 V；胞苷的Fragmentor 及CE 值分別為100、10 V；鳥苷的Fragmentor 及CE 值分別為90、10 V； 甘露醇的Fragmentor 及CE 值分別為70、10 V； 腺嘌呤的Fragmentor 及CE 值分別為100、30 V； 檢測對象： 腺苷m/z 268.1→m/z 136；胞苷m/z 244.2→m/z 112.1；鳥苷m/z 284.1→m/z 152.1；甘露醇m/z 183.1→m/z 69；腺嘌呤m/z 136.1→m/z 119.1。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液的制備 分別取標準品腺嘌呤、腺苷、胞苷、鳥苷、甘露醇適量，精密稱定，用50%甲醇溶解并定容，制成腺苷、胞苷、鳥苷、甘露醇、腺嘌呤質量濃度分別為320、160、480、3200、320 ng/mL 的混合對照品溶液。依次進行倍比稀釋，外標法定量分析。結果見表1。

表1 5 種化學對照品UPLC-MS/MS 分析濃度（ng/mL）

2.2.2 供試品溶液的制備 取金水寶膠囊內容物，研磨均勻，精密稱取0.5 g，置于50 mL 容量瓶中，用90%甲醇溶解并定容，超聲處理30 min（功率：45 kHz），搖勻，濾過。精密吸取上清液1 mL，置于100 mL 容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。按“2.1”項下條件進行測定，見圖1。

圖1 液-質聯用離子流圖

2.3 線性關系考察

使用“2.2.1”項下系列混合對照品溶液，按照“2.1”項下條件進行測定，以各化合物峰面積（Y）為縱坐標，相應濃度（X，ng/mL）為橫坐標，進行線性回歸，結果表明，腺苷、胞苷、鳥苷、甘露醇、腺嘌呤的質量濃度在相應范圍內與峰面積呈良好線性關系。 見表2。

表2 金水寶膠囊中5 種成分的線性回歸結果

2.4 精密度試驗

取低、中、高3 個濃度（HB5、HB4、HB2）的混合對照品溶液分別重復進樣5 次，按“2.1”項下條件進行測定，記錄峰面積。結果腺苷的RSD 分別為3.1%、1.9%、2.8%（n=5）；胞苷的RSD 分別為3.3%、3.2%、3.8%（n=5）； 鳥苷的RSD 分別為2.4%、2.8%、1.9%（n = 5）；甘露醇的RSD 分別為3.9%、4.1%、3.5%（n = 5）；腺嘌呤的RSD 分別為4.1%、3.8%、3.5%（n = 5），實驗結果符合中藥質量標準分析方法的要求[19]附錄130-131。

2.5 穩定性試驗

取樣品（批號：150515），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，室溫放置于進樣室中，放置0、4、8、12、24 h時按“2.1”項下條件進樣記錄峰面積。 結果腺苷、胞苷、鳥苷、甘露醇、腺嘌呤峰面積的RSD 分別為3.5%、2.2%、2.6%、3.1%、3.1%（n = 5），結果表明供試品溶液在24 h 內穩定均較好。

2.6 重復性試驗

取樣品（批號：150515），共6 份，按“2.2.2”項下供試品溶液的制備方法，配制供試品溶液。 按“2.1”項下條件進測定，記錄峰面積。結果腺苷、胞苷、鳥苷、甘露醇、 腺嘌呤峰面積的RSD 分別為3.2%、3.4%、2.6%、2.8%、3.1%（n = 6），符合試驗要求。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱定批號為150515 的樣品約0.25 g，精密加入各對照品溶液適量，按“2.2.2”項下方法制備，依法測定并計算回收率。 結果見表3，實驗結果符合中藥質量標準分析方法的要求[19]824-825。

2.8 樣品含量測定

取3 批金水寶膠囊，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下方法測定，計算每批金水寶膠囊中腺苷、胞苷、鳥苷、甘露醇、腺嘌呤的含量，結果見表4。

表3 加樣回收率試驗試驗結果（n = 6）

表4 金水寶膠囊中5 個化合物含量測定結果（n = 3）

3 討論

金水寶膠囊中的胞苷含量較低，紫外響應也較低，無法使用HPLC 法進行含量測定，同時，由于金水寶膠囊中化合物較多，不同成分之間相互干擾，這嚴重影響了相關成分的準確定量，故本實驗最終選擇分析速度快、靈敏度高的UPLC-MS/MS 法進行定量分析。

本試驗也考察了不同色譜柱、流動相及質譜條件對化合物定量的影響， 結果表明，Agilent ZOBAX SB C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，5 μm）效果較為理想，各化合物峰形良好，保留時間適中。 正離子模式下各化合物離子化效率高。 使用甲醇∶0.1%甲酸水溶液=5∶95時，各化合物分離較好，無相互干擾，出峰時間短。

2010 年版《中國藥典》中金水寶膠囊僅采用HPLC測定其中腺苷的含量[19]824-825，而本研究采用UPLCMS/MS 法同時測定金水寶膠囊中腺苷、胞苷、鳥苷、甘露醇、腺嘌呤的含量，該方法具有干擾少、分析時間短、靈敏度高、專屬性強的特點[20-23]，為全面控制金水寶膠囊提供了可靠而簡單的方法。

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