高效液相色譜法測(cè)定經(jīng)血寧膠囊中傘房決明苷含量

羅 軼，丘明明

(廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 南寧 530021)

經(jīng)血寧膠囊由白背葉和扶芳藤組方，為婦科止血藥，適用于瘀血阻滯月經(jīng)過多、經(jīng)色紫黑有塊、腹痛拒按等癥，也用于輕度消化道出血的輔助治療[1]。白背葉是方中君藥，為大戟科植物白背葉Mallotus apelta(Lour. )Muell-Arg. 的干燥葉[2]，主要有止血、抑菌、抗肝纖維化、抗癌等作用[3]。白背葉的乙醇提取物中能分離得到多種黃酮類成分[4]，傘房決明苷(corymboside)為其中一種，目前尚未見報(bào)道白背葉中該成分的含量測(cè)定方法。為此，筆者采用高效液相色譜法測(cè)定了經(jīng)血寧膠囊中傘房決明苷的含量，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1200 型高效液相色譜儀。傘房決明苷對(duì)照品(由廣西師范大學(xué)鑒定并提供，在335 nm 波長下，經(jīng)歸一化法檢查，純度為97.79%);甲醇為色譜純，水為高純水，聚酰胺(30 ～60 目)及其他試劑均為分析純。經(jīng)血寧膠囊(廣西金秀圣堂藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)分別為20120901，20120902，20120903)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Capcell Pak C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:磷酸鹽混合溶液(稱取磷酸氫二鈉1.8 g，磷酸二氫鉀2.8 g，和庚烷磺酸鈉1.0 g，加水稀釋至1 L，混勻，配成含庚烷磺酸鈉1 g/L 的磷酸鹽緩沖液，磷酸調(diào)節(jié)pH 至6)-甲醇(75 ∶25);柱溫:30 ℃;流速1.0 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL;檢測(cè)波長:335 nm。理論板數(shù)以傘房決明苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

2.2 溶液制備

精密稱取傘房決明苷對(duì)照品10.18 mg，置50 mL 容量瓶中，加甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為199.1 μg/mL的傘房決明苷對(duì)照品溶液。取本品內(nèi)容物，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流15 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，蒸干，殘?jiān)盟?0 mL 使溶解，加在聚酰胺柱(30 ～60 目，直徑1.5 cm，高10 cm)上，用水8 mL 洗脫，棄去洗脫液，用30%乙醇100 mL 洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)眉状际谷芙?，轉(zhuǎn)移置10 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn):取缺白背葉的陰性樣品，照供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照品溶液并測(cè)定。結(jié)果在傘房決明苷對(duì)照品保留時(shí)間處未出現(xiàn)色譜峰，表明陰性對(duì)照品溶液中的組分不干擾傘房決明苷的測(cè)定。見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:精密量取傘房決明苷對(duì)照品溶液(199.1 μg/mL)0.5，0.5，1.0，1.0，2.0，2.0 mL，分別置50，20，20，10，10，4 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)、對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為Y=17 122 X+1.889 6，r=0.999 6(n=6)。結(jié)果表明，傘房決明苷進(jìn)樣量線性范圍為0.001 991 ～0.995 5 μg。

精密度試驗(yàn):精密吸取同一份對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果峰面積積分值的RSD 為0.21%(n=6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，分別于0，6，10，17，29 h 時(shí)進(jìn)樣5 次，測(cè)定峰面積。結(jié)果峰面積積分值的RSD 為0.49%(n=5)，表明供試品溶液在29 h 內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一批(批號(hào)為20120901)樣品6 份，照供試品溶液的制備方法處理并依法測(cè)定。結(jié)果傘房決明苷含量的平均值為0.451 4 mg /g，RSD 為2.54%(n =6)，表明方法重現(xiàn)性良好。

加樣回收試驗(yàn):稱取已知含量(傘房決明苷的含量為0.451 4 mg/g)的同一批(批號(hào)為20120901)樣品約0.25 g，精密稱定，共9 份，分成3 組，每組分別按50%，100%，150%的比例精密加入傘房決明苷對(duì)照品，照供試品溶液的制備方法處理并依法測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 傘房決明苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果( n=9)

2.4 樣品含量測(cè)定

取批號(hào)為20120901，20120902，20120903 的樣品，每批平行操作2 份，依法制備供試品溶液并測(cè)定含量，結(jié)果每粒樣品中傘房決明苷含量分別為0.19，0.22，0.13 mg。

3 討論

以甲醇、乙酸乙酯、正丁醇為提取溶劑，考察加熱回流與超聲處理兩種提取方法，結(jié)果以甲醇加熱回流提取含量最高;為了進(jìn)一步純化樣品，比較D101 型大孔樹脂、中性氧化鋁、聚酰胺等3種柱凈化方式，結(jié)果聚酰胺能有效去除相關(guān)雜質(zhì)，達(dá)到純化效果。

對(duì)Capcell Pak C18柱、Ultimate XB-C18柱、Kromasi C18柱3 種不同品牌的色譜柱進(jìn)行了考察，結(jié)果被測(cè)成分均能達(dá)到基線分離，測(cè)定結(jié)果的RSD 為2.55%。流動(dòng)相比較了甲醇-0.2%磷酸溶液、甲醇-0.1%冰醋酸溶液、乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液和文中采用的流動(dòng)相，結(jié)果文中采用的流動(dòng)相峰形對(duì)稱性較好。用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)傘房決明苷對(duì)照品溶液、經(jīng)血寧膠囊溶液進(jìn)行光譜掃描，傘房決明苷對(duì)照品在335 nm 波長處有最大吸收，同時(shí)經(jīng)血寧膠囊樣品HPLC 圖中與傘房決明苷對(duì)照品保留時(shí)間一致的色譜峰在335 nm 波長處也有最大吸收，因此確定檢測(cè)波長為335 nm。

[1] WS-5053(B-0053) -2002，國家藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)(試行) [S].

[2] 廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳. 廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)(二冊(cè)) [M]. 南寧：廣西科學(xué)技術(shù)出版社，1996：87.

[3] 江蘇新醫(yī)學(xué)院. 中藥大辭典[M]. 上海：上海人民出版社，1977:731.

[4] 韋 松，曲 磊，鄭作文. 白背葉黃酮類化學(xué)成分研究[J]. 中成藥，2012(4)：691 -693.