高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用檢測蕎麥草中非法添加的苯乙雙胍

陳 江，劉 凱，肖 引，羅定強(qiáng)

(1. 武警陜西省總隊(duì)醫(yī)院，陜西西安710054;2. 陜西省食品藥品檢驗(yàn)所，陜西西安710061)

蕎麥草為蓼科植物，資源分布廣。蕎麥葉具有降糖、調(diào)脂作用[1]。中成藥中非法添加化學(xué)成分，特別是非法添加降糖類成分，會危害患者的生命安全[2-3]。目前尚未有文獻(xiàn)報道藥材中檢出非法添加化學(xué)成分，筆者收集了5 批蕎麥草，經(jīng)過高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)技術(shù)、多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)掃描模式進(jìn)行分析，其中1 批檢出苯乙雙胍。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

LC-20AD 型島津高效液相色譜儀，API3200 串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀，Analyst 1.5 工作站，甲醇(美國Fisher 公司)。乙酸銨為分析純(西安化學(xué)試劑廠)，超純水(美國Millipore 純水系統(tǒng));鹽酸苯乙雙胍對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為100922 -200701);5 批蕎麥草樣品均收購西安藥材市場，經(jīng)陜西省食品藥品檢驗(yàn)所鑒定為蕎麥地上部分。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測條件

色譜條件:色譜柱為Waters C18柱(150 mm×4.6 mm，3.5 μm)，流動相為甲醇-0.001 mol/L 乙酸銨(30 ∶70)，流速為0.2 mL/min。

質(zhì)譜條件:離子源溫度為450 ℃，離子化模式為ESI+，檢測模式為MRM;霧化氣(Gas1)氣流量為40.00 mL/min，輔助加熱氣(Gas2)氣流量為40.00 mL/min，氣簾氣(Curtain Gas)20.00 mL/min;噴霧電壓、去集簇電壓、碰撞能量電壓值優(yōu)化至最優(yōu)靈敏度。離子對質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.2 溶液制備

精密稱取鹽酸苯乙雙胍對照品6.02 mg，加甲醇制成每1 mL含602 ng 的溶液，搖勻，即得對照品貯備液。取本品粗粉2 g，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，稱定質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

表1 苯乙雙胍質(zhì)譜參數(shù)

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:精密吸取對照品貯備液2 mL，分別置100，50，25，10，5 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，分別得到12.04，24.08，48.16，120.4，240.8 ng/mL 的對照品溶液。分別精密吸取上述對照品溶液10 μL，按擬訂的條件測定，以化合物定量離子對的峰面積( Y)對相應(yīng)的濃度( X)進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得線性方程Y=28 200 X+2 270(r=0.998 6)。結(jié)果表明，鹽酸苯乙雙胍進(jìn)樣量在12.04 ～240.8 ng 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測限與定量限確定:以信噪比S/ N 約為3 時，檢測限為2.2 μg/Kg，S/ N 約為10 時，定量限為6.3 μg/Kg。

精密度試驗(yàn):精密吸取苯乙雙胍對照品溶液(48.16 ng/mL)，按擬訂的條件連續(xù)測定5 次，以定量離子對計(jì)算精密度。結(jié)果的RSD 為2.66% ( n=5)。

穩(wěn)定性試驗(yàn):精密密吸取苯乙雙胍對照品溶液(48.16 ng/mL)，按上述條件，分別在0，2，4，8，12 h 測定，以定量離子對計(jì)算。結(jié)果的RSD 為3.01% ( n=5)。

重復(fù)性試驗(yàn):精密稱取陽性樣品2 g，平行6 份，依法制備供試品溶液，根據(jù)苯乙雙胍定量離子對峰面積計(jì)算樣品中苯乙雙胍平均含量為1.52 μg/g，RSD 為3.13%(n=6)。

加樣回收試驗(yàn):取陰性樣品粗粉2 g，分別精密加入鹽酸苯乙雙胍對照品溶液(24.08，48.16，120.4 ng/mL)50 mL，每個濃度平行制備3 份，按供試品溶液同法制備，按上述條件測定，計(jì)算回收率。結(jié)果低、中、高濃度溶液的平均加樣回收率分別為85.6%，87.2%，89.6%，RSD 分別為2.1%，1.9%，1.6%(n=3)。

2.4 樣品檢測結(jié)果

按擬訂的LC-MS/MS 條件進(jìn)行測定，陽性樣品與對照品苯乙雙胍顯相同保留時間的多反應(yīng)監(jiān)測離子對色譜峰。結(jié)果見圖1。

3 討論

中成藥非法添加化學(xué)藥品的目的是為了提高療效、占有市場份額，但忽視了患者的健康安全，嚴(yán)重者可能危害生命。因此，監(jiān)管部門應(yīng)引起重視，加強(qiáng)宣傳與管理。本試驗(yàn)中采用LC-MS/MS、多反應(yīng)檢測掃描方式進(jìn)行樣品檢測。多反應(yīng)監(jiān)測模式可以看成2個SIM，試驗(yàn)時盡可能多選幾個離子對，基質(zhì)干擾時可更換相應(yīng)的離子對，以提高專屬性。判定陽性樣品時，除陽性樣品與對照品多反應(yīng)監(jiān)測離子對完全一致時，還應(yīng)計(jì)算樣品和對照品非定量離子對與定量離子對色譜峰的比值，僅當(dāng)兩者數(shù)值的相對偏差小于15%時方可判定兩者為同一物質(zhì)。另外，可利用定量離子計(jì)算陽性樣品的含量。試驗(yàn)時，優(yōu)化多反應(yīng)監(jiān)測離子對參數(shù)噴霧電壓、去集簇電壓、碰撞能量等條件，可提高靈敏度。

[1] 劉淑梅，韓淑英，崔國金，等. 甜蕎麥葉總黃酮降糖、降脂作用及機(jī)制[J]. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2003，24(9)：1 815.

[2] 楊 釗，陳安珍，吳愛英，等.UPLC-MS/MS 測定降糖類中成藥及保健品中11 種化學(xué)藥[J]. 藥物分析雜志，2009，29(12):2 127.

圖1 多反應(yīng)監(jiān)測離子對色譜峰

[3] 劉福艷，蔣 俊，謝元超，等. 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測中藥制劑中摻入的雙氯芬酸鈉和醋酸潑尼松[J]. 藥物分析雜志，2009，29(12):1 231.