免疫親和柱層析凈化-高效液相色譜法檢測中藥材中赭曲霉毒素A

李 浩

(廣西壯族自治區食品藥品檢驗所，廣西 南寧 530021)

赭曲霉毒素A(OTA)是赭曲霉毒素中最主要的一種，在紫外光下顯綠色熒光，屬于穩定的無色結晶化合物，呈弱酸性，溶于極性溶劑和碳酸氫鈉溶液，微溶于水，溶點為165 ℃[1-2]。目前，已知赭曲霉毒素A 能致癌、致畸、破壞免疫系統，對腎臟造成損害，還可導致神經中毒[3]。世界上許多國家和涉及安全衛生的國際組織已制訂了對赭曲霉毒素A 的限制性法律法規或限量標準[4-6]。中藥材在生長、收獲、運輸、貯藏、加工等過程中均有被霉菌污染的可能性，我國現行國家標準中赭曲霉毒素A 的檢測方法為薄層色譜(TLC)法和酶聯免疫吸附(ELISA)法。免疫親和柱是20 世紀90 年代在分析領域得到應用的新技術，溶液樣品的大分子通過與親和柱體內的特異蛋白結合，得到純度較高的特異性結合蛋白，再用合適的洗脫液將特異性結合蛋白洗脫出來，從而達到分離、純化的目的，由于該過程去掉了絕大部分干擾物，故大大提高了信噪比和方法的檢出限。對于含有多種干擾物質的中藥材，如何減少干擾是準確測定赭曲霉毒素A 最重要的前提，為此，筆者進行了試驗，現報道如下。

1 儀器與試藥

Ochra TestTM免疫親和柱(美國維康、德國拜發公司);Waters2695型液相色譜儀、Waters 2475 型熒光檢測器;KQ-100DB 型數控超聲波清洗器超聲機(昆山市超聲儀器有限公司);電子天平(Electronic Scale);pH 計(Mettler Toledo);高質量空氣泵(Hailea Aco-5502)。赭曲霉毒素A 標準品(Alexis 公司);乙腈、甲醇均為Fisher Scientific 色譜純;試驗用水均為超純水(Milli-Q Academic 0.22 μm 超純水機);磷酸鹽緩沖液(PBS，16 g 氯化鈉+2.4 g 磷酸氫二鈉+0.4 g 磷酸二氫鉀+0.4 g 氯化鉀，用990 mL 水溶解，再用濃HCL 調pH 至6.8，水稀釋至1 000 mL);洗脫液為5%吐溫(吐溫∶水=5 ∶95);提取液為80%甲醇;稀釋液為吐溫20 ∶PBS(5 ∶95)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱:Agilent Zorbax SB-C18柱(250 mm×4.60 mm，5 μm);柱溫:35 ℃;樣品溫度:10 ℃;流動相:乙腈-水-乙酸(49.5 ∶49.5 ∶1.0);流速:1 mL/min;檢測器:熒光檢測器;檢測波長:激發波長333 nm，發射波長460 nm。在此色譜條件下的色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

取赭曲霉毒素A 標準品(標示裝量為1.0 mg)，精密稱定0.99 mg，分次用乙腈溶解并轉移至10 mL 容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，作為貯備液(約100 μg /mL)。精密量取貯備液1 mL，用乙腈稀釋至含赭曲霉毒素A 約為1 000，10，2 ng/mL 的對照品溶液。取供試品粉末約5 g，精密稱定，加入2 ～3 g 氯化鈉，精密加入80%甲醇溶液50 mL，超聲10 min，玻璃濾紙濾過，精密量取濾液10 mL，置25 mL 容量瓶中，加含5%吐溫20 的pH=6.8 PBS 稀釋至刻度，搖勻，玻璃濾紙濾過，精密量取續濾液10 mL，過赭曲霉免疫親合柱，流速為1 mL/min，用水20 mL 分2 次洗柱，洗液棄去，使空氣進入柱子，精密量取甲醇1.0 mL 分2 次洗脫，洗脫速度為0.5 mL/min，收集洗脫液，用甲醇定容至1 mL，即得供試品溶液。

2.3 測定方法

分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，測定峰面積，用外標法計算供試品中赭曲霉毒素A的含量。以外標法定量、保留時間定性、峰面積定量，樣品中赭曲霉毒素A 含量按以下公式計算，X(ng/g)=(Ai× Cs× V)/(As×m)。式中，X 為樣品中含量(ng/g)，Ai為樣品溶液赭曲霉毒素A的峰面積，As為對照品溶液赭曲霉毒素A 的峰面積，Cs為對照品溶液質量濃度(ng/mL)，V 為稀釋體積，m 為樣品質量(g)。

2.4 方法學考察

最低檢出限測定:取赭曲霉毒素A 對照品溶液(質量濃度為1.98 ng/mL)進樣，根據信噪比S/ N=3 為檢出限，S/ N=10 為定量限，以赭曲霉毒素A 計，測定結果見表1。

線性關系考察:取對照品溶液(10 ng/mL)分別進樣5，10，20 μL，赭曲霉毒素A 對照品溶液(40 ng/mL)分別進樣5，10，20μL，以峰面積(Y)為縱坐標、赭曲霉素A 的絕對量(X，ng)為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=3051457X-87602，r=0.9996(n=3)。結果表明，進樣量在50 ～800pg 范圍內與峰面積線性關系良好。

表1 最低檢出限測定結果

精密度試驗:將1.98 ng/mL 的對照品溶液連續進樣5 次，每次20 μL，以赭曲霉毒素A 峰的峰面積值計算。結果的RSD 為0.7%(n=5)，表明儀器精密度良好。

重復性試驗:取樣品5 份，按擬訂方法制備供試品溶液，依法進樣測定。結果的RSD 為3.7%(n=5)，表明方法重復性良好。

加樣回收試驗:選擇易染赭曲霉毒素同時代表不同類型的中藥材，測定樣品的赭曲霉殘留量。取白術樣品進行加樣回收試驗，添加以赭曲霉毒素A 計分別為高(40.0 ng/g)、中(25.0 ng/g)、低(2.5 ng/g)3 個質量濃度。分別取樣品5 g，各加入對照品溶液(赭曲霉毒素A 含量為1 000 ng/mL)200，125，12.5 μL，分別加80%甲醇溶液至50 mL，按擬訂方法制備供試品溶液，依法進樣測定。結果見表3。取未檢出赭曲霉毒素A 的補骨脂樣品5 份，分別加1 000 ng/mL 的赭曲霉毒素A 對照品溶液125 μL，依法進樣測定。結果見表2 和表3。

表2 白術加樣回收試驗結果( n=3)

表3 補骨脂加樣回收試驗結果(n=5)

2.5 樣品含量測定

按擬訂方法測定白花蛇舌草、百合、白術、白芷(2 批)、柏子仁(2 批)、薄荷、補骨脂(2 批)等樣品中赭曲霉毒素A 的含量。結果見表4。

表4 樣品含量測定結果(μg/kg)

3 討論

流動相選擇:選擇乙腈-水時，赭曲霉毒素A 峰峰形不尖銳且變形，考慮是赭曲霉毒素A 的解離問題;選擇乙腈-水-冰醋酸時峰形良好;選擇甲醇-水-冰醋酸峰形不穩定，甚至不出峰;選擇甲醇-水時赭曲霉毒素A 不出峰或峰形極差。因此，本試驗中采用乙腈-水-乙酸(49.5 ∶49.5 ∶1.0)為流動相。

供試品溶液前處理優化:由于考察的中藥材中有一部分含有大量的脂肪類、油類，這些物質會吸附其他顆粒使之成團，從而把赭曲霉毒素包裹住，無法與免疫親和柱的特異蛋白充分結合，為了使提取效率、回收效果更好，操作更合理，分別使用高速均質器和大功率超聲機對樣品溶液進行提取回收試驗，先加入80%甲醇后，再加入標準品溶液，以防最后加入80%甲醇而使中藥材粉末成團而將標準品溶液中赭曲霉毒素A 吸附進去，造成回收率下降。經多次回收比較發現，多數中藥材使用高速均質器和超聲提取的回收率均較高且相差不大，而含油脂類較豐富的少數中藥材以使用超聲機時回收率更高，故使用超聲機提取更能廣泛應用于中藥材的赭曲霉毒素A 檢測。赭曲霉毒素A 溶于非極性溶劑和稀碳酸氫鈉溶液，試驗中經過多次篩選，發現甲醇-水(80 ∶20)作為提取溶劑時提取效果最好，加標回收率在74.6%以上。由于赭曲霉毒素A 在強酸及強堿溶液中易被破壞，經多次試驗發現，當溶液pH 為5.6 ～7.1 時赭曲霉毒素A 回收率較高，通過篩選pH 相差較大的中藥材進行回收試驗，最后得出結論，當加入pH=6.8 的PBS 時，可將補骨脂提取溶液pH 由2.696 調至5.601，此時的回收率均能達到84%以上。

凈化條件選擇:OchraTest 免疫親和柱的優點是具有高度的特異性，使用時不需要活化，但上樣時有機溶劑的含量應嚴格控制，甲醇和乙腈等有機溶劑的體積分數不能超過20%，否則會破壞柱體基質，影響赭曲霉毒素A 抗原抗體結合反應。試驗中將80%甲醇稀釋了5 倍，使其濃度降為16%，然后才過免疫親和柱，最后用純甲醇將赭曲霉毒素A 抗原抗體結合位點破壞，使赭曲霉毒素A 脫落流出。

洗脫液選擇:試驗多次對比使用甲醇、乙腈洗脫后的回收效果，發現使用甲醇的回收率與乙腈相差很小，且甲醇比乙腈便宜，對試驗人員的毒副作用較小，故選用甲醇作為赭曲霉毒素A 的洗脫液。

中藥材中赭曲霉毒素A 添加范圍為2 ～50 ng/g 時，加樣回收試驗的回收率為64.4% ～106.0%，RSD 為0 ～28.5%。該方法簡單可行，結果準確，可用于中藥材中赭曲霉毒素A 的檢測。

本研究中的免疫親和柱層析凈化-高效液相色譜法測定中藥材中的赭曲霉毒素A，方法簡單可行，結果準確，可為我國一直空缺的中藥材赭曲霉毒素檢測標準提供快速、準確的定性定量檢測方法。本方法的適用范圍和檢測低限基本滿足《食品衛生標準》的限量要求，也可滿足出入境檢驗檢疫、產品質量監督、工商管理、疾病預防等政府實驗室及企業產品質量把關對赭曲霉毒素A 的檢測需要。

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