高效液相色譜-蒸發(fā)光散射器法測定芪芳氣血顆粒中黃芪甲苷含量

吳高芬

(湖南省岳陽市食品藥品檢驗所，湖南 岳陽 414000 )

芪芳氣血顆粒收載于國家藥品標準(試行) [WS -5804 (B-0804)-2002]，由黃芪、當歸、熟地黃等9 味藥材組方，具有益氣補血的功效。原標準用薄層掃描測定黃芪甲苷的含量，該方法受展開環(huán)境等諸多因素影響，且需顯色后掃描，結(jié)果不穩(wěn)定[1]，重復(fù)性也難以達到要求。為確保產(chǎn)品質(zhì)量，筆者采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射器(HPLC-ELSD)法對產(chǎn)品中黃芪甲苷的含量進行測定，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

Waters Alliance 2695 型高效液相色譜儀，包括e2695 溶劑管理系統(tǒng)，2424ELS Detector Empower 工作站(美國Waters 公司);XS-105 型電子天平(上海梅特勒-托利多公司，精密度為0.01mg)。乙腈為色譜純;水為純化水;黃芪甲苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號為110781-201314，含量為95.8%);芪芳氣血顆粒(恒拓集團廣西圣康制藥有限公司，批號為130201)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Ultimate XB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈-水(34 ∶66)[2];流速:0.9 mL/min;漂移管溫度:65 ℃;增益:40;數(shù)據(jù)率:1 PPS;空氣壓力:20.0 psi(1 psi=6.895 kPa);柱溫:30 ℃。

2.2 溶液制備

精密稱取黃芪甲苷對照品12.38 mg，置25 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，制成每1 mL 含0.5 mg 的對照品溶液。精密稱取本品15 g(約1 袋)，精密加水50 mL 使溶解[3]，用水飽和的正丁醇振搖，提取4 次，每次40 mL，合并正丁醇提取液，正丁醇提取液用濃氨試液[4]洗滌2 次，每次40 mL，棄去洗滌液，正丁醇液蒸干，殘渣用甲醇溶液并轉(zhuǎn)移至5 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。按芪芳氣血顆粒處方比例取缺黃芪的方中其他藥材制成陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

陰性干擾試驗:分別取2.2 項下3 種溶液20 μL，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相同保留時間處有一致的色譜峰，陰性對照品溶液色譜無此吸收峰，見圖1。

線性關(guān)系考察:精密吸取對照品溶液5，10，15，20，25 μL，按擬訂色譜條件進樣測定。以黃芪甲苷進樣量的自然對數(shù)(X)為橫坐標、峰面積的自然對數(shù)(Y)為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=1.470 3 X+4.432 5，r=0.999 6( n=5)。結(jié)果表明，黃芪甲苷進樣量在2.37 ～11.86 μg 范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。

精密度試驗:精密吸取同一對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6 次，測定峰面積積分值。結(jié)果的RSD 為0.57%(n=6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗:精密吸取同一供試品溶液(批號為130201)，分別于0，3，6，9，12，24 h 時進樣測定峰面積。結(jié)果的 RSD 為0.83%(n=6)，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗:取芪芳氣血顆粒(批號為130201)，依法平行制備供試品溶液6 份。精密吸取10 μL 注入高效液相色譜儀，計算黃芪甲苷的含量。結(jié)果平均含量為每袋1.41 mg，RSD 為1.32%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗:精密稱取已知含量的樣品(批號為130201，每袋含量為1.41 mg)7.5 g，加入上述對照品溶液1.5 mL，精密加水50 mL 使溶解，依法制備同一質(zhì)量濃度的供試品溶液6 份，進樣測定，計算回收率。結(jié)果見表1。

圖1 高效液相色譜圖

表1 黃芪甲苷加樣回收試驗結(jié)果(n=6)

2.4 樣品含量測定

取3 批樣品，按擬訂色譜條件進樣測定含量。結(jié)果批號為130201，130301，130401 的樣品中黃芪甲苷含量分別為每袋1.41，1.32，1.38 mg。

3 討論

蒸發(fā)光散射器為質(zhì)量型檢測器[5]，適用于僅有末端吸收[6]或無紫外吸收的皂苷類化合物的測定，不受官能團的影響，不受流動相溶劑干擾，前處理簡單，分離度高，回收率高，是目前測定黃芪甲苷含量較好的方法，故選擇HPLC-ELSD 測定芪芳氣血顆粒中黃芪甲苷的含量，并優(yōu)化漂移管溫度、氣流速、增益、數(shù)據(jù)率等因素對峰形的影響，有效保證測定方法的靈敏度及準確性。

黃芪甲苷為環(huán)菠蘿蜜烷型四環(huán)三萜類皂苷。皂苷在含水丁醇或戊醇中溶解度較好[7]，且樣品中的黃芪甲苷已被提取，直接加水溶解，用水飽和的正丁醇提取，且正丁醇提取液一般不含單糖、多糖等雜質(zhì)，便于分析。

曾采用濃氨試液(每次40 mL，2 次)與氨試液[5](每次40 mL，2 次)及1%氫氧化鈉溶液[8](每次20 mL，4 次)洗滌正丁醇提取液，結(jié)果同體積的濃氨試液及1%氫氧化鈉溶液提取黃芪甲苷的量較氨試液約多1 倍。在堿性環(huán)境下，黃芪皂苷Ⅰ和Ⅱ向黃芪甲苷Ⅳ轉(zhuǎn)化[9]。在一定堿性范圍內(nèi)，堿性越強，黃芪皂苷Ⅰ和Ⅱ向黃芪甲苷Ⅳ轉(zhuǎn)化越完全。

[1] 李鏡友，陳 軍，羅巧紅，等. HPLC-蒸發(fā)光散射檢測法測定益氣溫陽膠囊中黃芪甲苷的含量[J] . 中醫(yī)藥導(dǎo)報，2009，15(7):86.

[2] 李 毅，王 穎，張廷模. 活血散結(jié)合劑中黃芪甲苷的含量的測定[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2011，22(3):769.

[3] 丁水平，馬寶瑕，張 銳. 黃芪甲苷在黃芪及制劑質(zhì)控中的應(yīng)用[J].中國藥師，2001，4(5):361

[4] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(一部)[M]. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:790 -791.

[5] 唐德智，莫 迎. 高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法測定小兒健脾開胃合劑中黃芪甲苷的含量[J]. 中國藥業(yè)，2010，19(6):22.

[6] 匡海學(xué). 中藥化學(xué)[M]. 北京:中國中醫(yī)藥出版社，2003:240.

[7] 李 飛，周洪雷，杜昊忱，等. 高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法測定心腦補益口服液中黃芪甲苷的含量[J]. 中國藥業(yè)，2011，20(5):16.

[8] 吳永平，徐永梅，曹 園，等.HPLC-ELSD 法測定黃芪提取物中黃芪甲苷的含量[J]. 中成藥，2001，23(9):674.

[9] 汪 祺，張聿梅，戴 忠，等. 黃芪中皂苷類成分的特征薄層圖譜鑒別[J] . 中國藥事，2011，23(12):1 229.