NF-κB活化在腸缺血再灌注全身多臟器的表達及意義

鄭德義 王毅 杜嬌 李平洋 肖向陽 程代薇 李自力

（貴州省人民醫院燒傷整形科，貴州 貴陽550002）

腸 缺 血 再 灌 注 （intestinal ischemia／reperfusion，II／R）損傷常繼發于嚴重創（燒）傷、休克及危重病患者。II／R促進腸道細菌和內毒素移位，氧自由基損傷、過度或失控的炎性細胞因子和炎性介質的合成及釋放，不僅引起腸損傷，而且導致遠隔器官如肝、肺及腎臟等多器官損害［1］。失控性炎癥反應在II／R損傷病理過程中起重要作用，但其發病的分子機理尚未完全闡明。核因子－κB（nuclear factorκB，NF-κB）主要調控炎性細胞因子基因的轉錄，NF-κB的活化在急性肝、肺損傷的發生發展中起重要作用［2－3］。內毒素血癥、TNF-α、IL-1、缺血／ 再灌注、活性氧等因素都能活化 NF－κB，但是，II／R后全身各重要臟器NF-κB的活化情況目前尚不完全清楚。本研究旨在探討C57BL／6小鼠在II／R后多臟器損害中NF－κB的活化規律及其可能作用。

1 材料與方法

1.1 動物分組 10周齡健康雄性C57BL／6小鼠，體質量22～26g，動物隨機分為假手術組（S）、缺血再灌注組（II／R）。II／R組按缺血后不同再灌注時間又分為再灌注即刻（0）、0.5h、1h、4h、6h和12h組，每組6只。實驗過程符合動物倫理學要求并得到醫院倫理學委員會批準。

1.2 模型制備及標本的采集 參照以前實驗方法［4］，術前禁食12h，自由飲水，腹腔注入1%戊巴比妥鈉（50mg·kg－1）麻醉，仰臥固定、常規0.5%碘伏消毒，經腹壁中線切口入腹腔。外置腸攀溫鹽水紗布覆蓋，暴露左側腹腔，鈍性分離并用無創動脈夾夾閉腸系膜前動脈，假手術組不夾閉，暫時關閉腹腔，皮下注入生理鹽水1mL，缺血40min松開動脈夾，腸道血供恢復，縫線關閉腹腔，自由飲水。腸缺血恢復再灌注后相應時間點經麻醉處死小鼠，立即取小腸、肝及肺組織于冰鹽水中漂洗，置－80℃深低溫冰柜保存。II／R6h，分別取距回盲部5cm回腸、右上肺葉、肝及腎臟組織于10%多聚甲醛固定，待病理學檢測。

1.3 病理學檢查 回腸、肺、肝臟及腎臟組織常規病理切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察組織病理變化。

1.4 EMSA檢測腸、肝、肺和腎臟NF－κB活化 組織核蛋白提取EMSA檢測方法參照文獻［5］，BCA法定量蛋白濃度后，置－80℃保存。探針采用NF－κB一致性的雙鏈寡核苷酸序列（5’AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC3’）（Santa Cruz Bio-technology），5’端以γ-32P ATP（Amersham Biosciences）標記。5μg細胞核提取物與32P標記的 NF－κB雙鏈寡核苷酸探針進行結合反應，室溫下與poly-（dI：dC）結合緩沖液孵育20min；配制6%非變性聚丙烯酰胺凝膠，90V電壓電泳后1.5h取出凝膠板、干膠處理，凝膠經保鮮膜覆蓋并放入裝有X線片的暗盒中，在－70℃放射自顯影24h，然后顯影、定影。對X線片上電泳帶進行密度掃描，NF-κB活性以面積×密度表示。用quantity one圖像分析軟件處理得出光密度值，與假手術組密度值的比值計算其相對表達量。

2 結 果

2.1 腸、肺、肝臟及腎臟組織病理學改變 假手術組（S組）腸、肺、肝臟及腎臟組織形態正常。II／R后6h腸、肺、肝臟及腎臟發生病理改變，主要表現為回腸黏膜層糜爛、潰瘍形成，黏膜下層水腫或變性、壞死，黏膜層、黏膜下層炎性細胞浸潤；肺組織充血、水腫，肺間質炎性細胞浸潤；肝細胞水樣變性、氣球樣變性，部分有炎性細胞浸潤；腎小管上皮細胞水腫。見圖1。

圖1 II／R后腸、肺、肝和腎臟組織病理學變化（HE×100）

2.2 腸、肝和肺 NF－κB活化情況 II／R引起腸、肝及腎臟組織NF－κB活化。與假手術組比較，缺血再灌注腸組織NF－κB持續活化，尤以再灌注4h、6h升高明顯（P＜0.01）；在肝臟組織，NF-κB活化表現呈升高—降低—再升高雙峰型特點，缺血再灌注0.5h、6h和12hNF－κB活化明顯（P＜0.01）；在肺組織，腸缺血期NF－κB即活化，再灌注1h、4h及12hNF-κB活化明顯（P＜0.01），表現呈升高—降低—再升高重復活化特點。見圖2。

圖2 II／R后腸、肝和肺組織NFκB活性變化

3 討 論

II／R損傷、腸黏膜屏障受損引起的腸源性感染，誘發全身炎性反應，導致肺、肝、腎臟等遠隔臟器的損害，是ARDS和 MODS發生的重要原因［6－7］。研究證實，II／R早期，不僅導致腸損傷，而且引起遠隔器官肝、肺及腎臟等多臟器損害。目前認為，腸損傷后腸黏膜屏障受損及功能下降促使腸道細菌及內毒素移位、中性粒細胞活化、氧自由基和各種炎性細胞因子的過度合成及釋放、炎癥反應在II／R損傷病理過程中有重要作用。

NF-κB是調控炎癥反應的中樞環節，目前已知NF-κB／Rel家族成員有 Rel A （p65 ）、Rel B、CRel、p105／p50 （NF-кB1）、p100／p52 （NF-кB2）。靜息狀態下，NF-κB多以p50／p65異二聚體狀態與抑制蛋白IκB相結合而存在于細胞質中，當細胞受到炎性細胞因子、氧化劑、細菌內毒素等多種胞內外信號的刺激［8－9］，細胞質內 NF-κB 結合的IκB 磷酸化、泛化，進而降解并暴露出NF-κB的核定位序列，NF-κB由此轉入核內與DNA分子上的κB單元結合，發揮其轉錄調節功能［10］，從而調控多種炎性細胞因子、黏附分子、趨化因子和生長因子的表達，在機體的免疫應答、炎癥反應及細胞增殖和凋亡等方面發揮重要的作用。所以，明確II／R后腸道本身及如肺、肝等遠隔器官NF-κB活化規律有重要意義。

本研究結果表明，II／R早期，腸組織 NF－κB活化，腸缺血恢復血流灌注0.5h，肝臟NF-κB達活化高峰，6～12h再次形成活化高峰；在肺組織，腸缺血期 NF－κB活化，再灌注1～4h和12hNF－κB再度明顯活化，表現呈升高—降低—再升高重復活化特點。可以認為，腸缺血損傷產生細菌內毒素脂多糖、氧自由基等多種胞內外信號的刺激因素［9］，隨血液再灌注進入全身各器官組織，導致肝、肺等器官組織NF－κB活化并與κB序列的DNA結合，啟動基因的轉錄和表達，產生大量炎性細胞因子，參與II／R肝、肺及腎臟等多臟器損害。組織損傷、大量炎性細胞因子如TNF-α、IL-1等以正反饋調節機制刺激NF-κB，進一步激活 NF－кB信號系統，從而形成正反饋的級聯放大效應，加劇炎癥反應，NF-κB活化成為炎癥調控的樞紐和關鍵。因此，缺血再灌注早期，在產生炎癥細胞因子的上游水平抑制或阻斷NF-κB的激活通路，可能成為減輕II／R損傷的治療靶點，值得進一步研究。

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