葛根素保護壓力負荷誘導的心肌肥厚

吳青青 唐其柱

心肌肥厚是心臟在遭受各種刺激，如機械刺激(高血壓、瓣膜狹窄)和神經體液刺激(血管緊張素2、內皮素-1、腎上腺素等)引起的心臟適應性反應，其主要特征包括心肌細胞肥大、蛋白質合成增多、胚胎基因的激活［1，2］。早期心肌肥厚可代償心臟對各種刺激的反應，然而持續的心肌肥厚最終會使心臟走向失代償，引發心力衰竭［3，4］。因此心肌肥厚的防治對降低心力衰竭發生、發展尤為重要，然而目前臨床上仍無藥物能有效預防甚至逆轉心肌肥厚，因此尋找防治心肌肥厚的新靶點和新藥物刻不容緩。

葛根素為葛根的主要活性成分。在中國古代醫學中葛根被廣泛用于治療發熱、急性痢疾、腹瀉、糖尿病和心血管疾病等［5］。近年來，多數研究表明葛根素可以抑制炎性細胞的浸潤，抑制炎性細胞因子的分泌［6］。此外葛根素還具有抗細胞凋亡以及抗氧化作用［7，8］。在心臟中的研究表明葛根素促進小鼠胚胎干細胞衍生的心肌細胞的T 管的發育，葛根素通過調節P2X3 受體能減輕大鼠心肌缺血誘導的大鼠頸上神經節交感興奮的反應［9，10］。葛根素通過降低心肌TGF-β1 的表達抑制異丙腎上腺素引起的小鼠心肌纖維化［11］。上述研究均表明葛根素在心臟中發揮著重要作用，然而其在壓力負荷誘導的心肌肥厚中的作用尚不明確。本研究采用胸主動脈縮窄術(aortic banding，AB)建立小鼠心肌肥厚模型，探討葛根素在心肌肥厚中的作用及可能機制。

材料與方法

1.實驗動物:雄性C57/BL6 小鼠購買于中國醫學科學院醫學實驗動物研究所。

2.實驗分組:①假手術組(n=7);②AB 手術組(n =12);③葛根素+AB 組(n =12)。其中③組于手術1 周后開始給藥，藥物根據小鼠飲食量加至小鼠食物中保證每日給藥量為65mg/(kg·d)，連續喂至術后12 周，取心臟。

3.胸主動脈縮窄術:用3%戊巴比妥鈉溶液腹腔麻醉小鼠，備皮，氣管插管后用呼吸機輔助呼吸。小鼠右側臥位，固定好雙上肢和下肢，用碘酒及75%乙醇對手術區皮膚進行清潔消毒。在第2、3 肋間開胸，用擴胸器撐開胸腔，用細棉簽向右下撥開左肺，顯微剪剪開縱隔，鈍性無齒直鑷和彎鑷游離出主動脈弓降支，并將7 -0 結扎線穿過血管，在血管上方平行放置1 個26G/27G 注射器針頭，將血管及針頭一起結扎，迅速抽出針頭即可達到血管縮窄，關胸。假手術組只掛線不結扎，術后護理1 周，以后每天觀察記錄小鼠死亡情況。

4.心臟取材:稱量小鼠體重記錄后采用頸椎脫臼處死法迅速處死小鼠。將處死的小鼠放在鋪有手術治療巾的手術臺上，用浸透雙蒸水的紗布塊濕潤胸腹部毛發，用眼科鑷夾住小鼠劍突處皮膚，用手術剪沿胸骨正中向頭剪開皮膚，再提起劍突剪開橫隔，剪去胸骨和左右肋骨充分暴露心臟和雙肺;用眼科彎鑷夾住兩心耳下方血管蒂剪下小鼠心臟后放入10%KCl 溶液中讓心臟在舒張期停跳，輕輕擠出心腔內的液體，修剪心臟，稱重記錄，將心臟置于10%甲醛溶液中固定。取出小鼠肺重稱重記錄。將小鼠右下肢脛骨皮膚剪開，測量脛骨長度。

5.病理染色:經甲醛溶液固定的心臟脫水，石蠟包埋切片后，在60℃烤箱中烘烤30min 以上，經脫蠟水合后用0.2%Triton 通透組織細胞。用8%羊血清封閉60min，減少非特異性染色。用p-NF -κB 一抗孵育過夜，Alexa Fluor?568 goat anti-rabbit 二抗孵育60min 后，DAPI 染細胞核封片。在顯微鏡下觀察并拍照。

6.統計學方法:采用SPSS 13.0 軟件所有數據用均數±標準差(±s)表示，兩組之間的比較用非配對t -檢驗;多組之間的比較用多因素方差分析，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1.葛根素減輕壓力負荷誘導的心肌肥厚:術后12 周取材結果顯示AB 手術組小鼠心重體重比(heart weight/Body weight，HW/BW)，肺 重 體 重 比(lung weight/Body weight，LW/BW)，心重脛骨長度比(heart weight/tibia length，HW/TL)明顯高于假手術組，表明胸主動脈縮窄術誘導的心肌肥厚模型成功，而葛根素+ AB 組的HW/BW、LW/BW、HW/TL 明顯低于AB 手術組(表1)，表明葛根素能顯著抑制壓力負荷誘導的心肌肥厚。

表1 各組心肌肥厚程度比較

2.葛根素降低死亡率:術后12 周觀察到每組小鼠死亡情況，發現假手術組無死亡;AB 手術組小鼠死亡率為50%，表明小鼠多心力衰竭死亡;而葛根素+AB組小鼠死亡率為25%(P ＜0.05，圖1)。改組數據表明葛根素能提高心肌肥厚甚至心力衰竭小鼠的生存率。

圖1 各組件生存率的比較

3.葛根素抑制NF -κB 的核轉位:NF -κB 是參與心肌肥厚病理過程的一類重要轉錄因子，主要參與炎癥、免疫、凋亡等多種基因的轉錄調控。在心肌肥厚過程中存在著NF-κB 信號通路的過度激活，因此本研究探討葛根素是否會通過阻斷NF -κB 信號通路抑制心肌肥厚的發展。小鼠心臟石蠟切片病理染色結果顯示，手術組小鼠心臟NF-κB 核轉位現象明顯增多，而葛根素能顯著抑制NF -κB 的核轉位(圖2)，提示葛根素通過阻斷NF-κB 信號通路發揮抗心肌肥厚的作用。

圖2 各組NF-κB 核轉位的免疫熒光染色結果

討 論

以往的研究表明葛根素具有抗炎、抗氧化以及抗凋亡的作用，同時葛根素在心臟中能減輕心臟缺氧損傷、減少異丙腎上腺素誘導的心臟纖維化且葛根素還能促進心肌細胞的發育［6～10］。以往的研究更報道葛根在中國古代醫學已廣泛用于心血管疾病和糖尿病的治療［5］。然而葛根素在心肌肥厚中的作用尚不明確，鑒于炎癥、氧化應激和凋亡在心肌肥厚的發展過程中發揮著重要作用［12，13］。筆者猜測葛根素可能能夠抑制心肌肥厚的發展。本實驗結果表明葛根素能明顯減輕壓力負荷誘導的心肌肥厚，同時降低小鼠AB 術后心肌肥厚向心力衰竭發展過程中的死亡率。然而其作用機制需探明。

NF-κB 是一個轉錄因子蛋白家族，包括5 個亞單位:Rel (cRel)、p65 (RelA，NF - κB3)、RelB 和p50(NF-κB1)、p52(NF-κB2)。NF -κB 通常以同源或異源二聚體的形式存在于細胞內，通過與細胞核內相應靶基因上的特異性結合序列結合而調控靶基因的轉錄，其主要參與調節炎癥、免疫、凋亡等多項病理生理過程。NF -κB 轉錄因子蛋白家族中最常見的二聚體為p65/p50 組成的異源二聚體，在靜止的細胞中NF-κB 與其抑制蛋白IκB 結合，后者通過其C末端特定的錨蛋白重復序列阻止NF -κB 向細胞核轉位發揮作用，而當細胞受到外界刺激時，IκB 磷酸化失活，NF-κB 向核內轉移與特異性位點結合促進靶基因的轉錄，而發揮相應作用［14］。在心肌肥厚過程中NF-κB 過度激活，通過調節多種基因的表達參與心肌肥厚的發展［15］。而本研究結果顯示葛根素能抑制NF-κB 的核轉位，提示葛根素發揮其抗心肌肥厚的作用主要是通過抑制NF-κB 信號通路。

本實驗尚存在不足之處，對葛根素如何調節NF-κB 的具體機制尚不清楚，需要更進一步研究探索。但總結本實驗結果，葛根素可能成為干預心肌肥厚和心力衰竭的新藥物，本實驗為尋找防治心肌肥厚和心力衰竭的新靶點和新藥物提供了理論基礎。

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