KD 患兒血清對細(xì)胞活力及NF-κB 表達(dá)的影響和PDTC 的干預(yù)

薛超超 李 豐 仇慧仙 陳 其 張園海

川崎病( Kawasaki disease，KD) 是一種以全身中小血管炎為主要病變的兒童急性發(fā)熱出疹性疾病，主要并發(fā)癥是冠狀動脈損害，可表現(xiàn)為冠脈擴張或者冠脈瘤［1］。近年來越來越引起兒科醫(yī)師重視。遺憾的是至今未能建立公認(rèn)穩(wěn)定的KD 動物模型，研究多基于臨床或體外細(xì)胞實驗。雖然發(fā)病機制仍不完全清楚，但必然存在免疫系統(tǒng)的異常激活與炎性反應(yīng)的過度擴大［2］。核因子-κB( NF -κB) 是一種具有基因轉(zhuǎn)錄功能的多項調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，在體內(nèi)炎性反應(yīng)過程中起到核心作用，能促發(fā)下游炎性連鎖反應(yīng)，所有炎癥相關(guān)性疾病中幾乎均能發(fā)現(xiàn)該通路的異常激活［3～6］。那么與冠脈病變密切相關(guān)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，其細(xì)胞內(nèi)的NF -κB 信號通路能否在KD 患兒血清刺激下是否被過度激活，進(jìn)而過度分泌各種細(xì)胞因子和炎性因子，造成細(xì)胞自身損害呢? 如果給予NF -κB 信號通路的抑制劑對該通路進(jìn)行阻斷，能否減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞的自身損害? 為證實這些猜想，筆者做了相關(guān)實驗研究，現(xiàn)報道如下。

資料與方法

1.研究對象：2012 年7 月～2013 年6 月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬育英兒童醫(yī)院兒童心血管科住院治療的KD 急性期患兒30例，KD 診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2004 年美國兒科學(xué)會和心臟病學(xué)會制定的KD 診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］。病程均在1 周以內(nèi)，未經(jīng)過IVIG 治療，排除其他免疫缺陷或者其他基礎(chǔ)疾病。其中男性18 例，女性12 例，患兒年齡3 個月～4 歲，平均年齡2.3 ±1.4 歲。對照組為同期在筆者醫(yī)院兒童保健科體檢患兒30 例，其中，男性16 例，女性14 例，患兒年齡3 個月～4 歲，平均年齡2.56 ±2.22 歲，檢查證實肝腎心功能正常，無基礎(chǔ)心血管疾病，無感染性疾病依據(jù)。

2.標(biāo)本采集： 抽取KD 患兒及對照兒童外周靜脈血2ml，EDTA-K2 抗凝，1500r/min 離心5min，收集上清液，-80℃冰箱保存。

3. 細(xì)胞培養(yǎng)與分組： HUVEC 在RPMI1640 培養(yǎng)液( 含15%胎牛血清) 中培養(yǎng)24h，觀察細(xì)胞已貼壁，生長良好，控制密度約1 ×106/培養(yǎng)瓶。隨機分成4 組( 每組設(shè)10 個平行組) ：對照組( N 組) ，KD 血清組( K 組) ，IVIG 組( G 組) ，PDTC組( P 組) ，除去舊培養(yǎng)液，分別予不同的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)( 表1) ，24h 后取出，用于下一步實驗。

表1 各組培養(yǎng)液及干預(yù)情況(±s)

表1 各組培養(yǎng)液及干預(yù)情況(±s)

分組 培養(yǎng)液及藥物干預(yù)對照組( N 組) RPMI1640 培養(yǎng)基+15%正常兒童血清KD 血清組( K 組) RPMI1640 培養(yǎng)基+15% KD 患兒血清IVIG 組( G 組) RPMI1640 培養(yǎng)基+15% KD 血清+IVIG(10g/L)PDTC 組( P 組) RPMI1640 培 養(yǎng) 基 + 15% KD 血 清 + PDTC(100μmol/L)

4.MTT 檢測細(xì)胞活力： 取培養(yǎng)瓶中的HUVEC，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 ×105/ml，接種于96 孔板，每孔加入100μl 細(xì)胞懸液，放入培養(yǎng)箱孵育24h，按實驗的4 組給與不同的處理，每組設(shè)5 個平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h。然后每孔加5mg/ml MTT 20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h，每孔加入二甲基亞砜( DMSO) 100μl，震蕩10min，使晶體完全溶解，酶聯(lián)免疫儀在波長490nm 處讀取吸光度的A 值。

5.RT-PCR 檢測NF - κB p65mRNA 的表達(dá)： 通過檢索GenBank 數(shù)據(jù)庫，利用Primer 5.0 軟件設(shè)計引物，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列和預(yù)期PCR 產(chǎn)物長度見表2，用前稀釋成10pmol/μl。按RNA 抽提試劑盒( Fermentas U.S.A) 說明書進(jìn)行HUVEC 中RNA 的提取，RNA 的反轉(zhuǎn)錄，然后放入25μl 普通PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件見表3，擴增完成后取10μl PCR 擴增產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠上電泳(120V，25 ～30min) ，紫外線燈下照相，用GelPro31 軟件測電泳條帶的IOD 比值。

表2 引物序列和預(yù)期PCR 產(chǎn)物長度

表3 目的基因的PCR 反應(yīng)條件

6.Western blot 法檢測HUVEC 胞核內(nèi)NF -κB p65 蛋白的表達(dá)：按照碧云天核蛋白提取試劑盒說明書來提取HUVEC細(xì)胞核蛋白，BCA 法測蛋白濃度，制膠，各孔加入100μg 蛋白樣品電泳，轉(zhuǎn)膜，5%小牛血清封閉液封閉1h，加兔抗單克隆抗體NF-κB p65 65kDa 一抗(1∶500) 和兔抗單克隆抗體β-actin 45kDa(1∶1000) ，4℃孵育過夜。TBST 洗膜3 次，加辣根過氧化物酶( HRP) 標(biāo)記的羊抗兔二抗( 1∶5000) 室溫孵育1h，TBST 洗膜3 次，膜與化學(xué)發(fā)光檢測試劑反應(yīng)5min，曝光。利用Quantity One 凝膠分析軟件測定條帶的IOD 比值。

7.統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件分析，全部數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗，計數(shù)資料均值用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s) 表示，多組比較采用單因素方差分析( ANOVA) ，方差齊者兩兩之間比較采用SNK-q 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.MTT 法檢測各組HUVEC 的細(xì)胞活力： 各組HUVEC 細(xì)胞活力的A 值見表4，圖1。結(jié)果顯示： ①KD 血清刺激下，HUVEC 的細(xì)胞活力較對照組顯著降低( P ＜0.05) ； ②在丙種球蛋白或PDTC 的干預(yù)下，HUVEC 的細(xì)胞活力較單純KD 血清刺激組均有顯著升高，且兩種干預(yù)措施組間比較細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表4 各組HUVEC 活力的A 值(±s)

表4 各組HUVEC 活力的A 值(±s)

與N 組相比，* P ＜0.05；與K 組相比，#P ＜0.05

組別 n A值10 0.612 ±0.036 K 組 10 0.325 ±0.054*G 組 10 0.576 ±0.047#P 組 10 0.516 ±0.032 N 組#

圖1 各組HUVEC 細(xì)胞活力的A 值比較

2. RT - PCR 檢 測 各 組HUVEC 中NF - κB p65mRNA 的 表 達(dá)： 各 組 HUVEC 的 NF - κB p65mRNA 電泳的灰度圖( 圖2) 及累計光密度相對值( IOD) ( 表5，圖3) 。結(jié)果顯示： ①KD 血清刺激下，NF- κB p65mRNA 表達(dá)較對照組顯著增加( P ＜0.05) ；②在丙種球蛋白干預(yù)下，NF -κB p65mRNA表達(dá)較單純KD 血清刺激組有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義； ③在PDTC 的預(yù)下，KD 血清中NF - κB p65mRNA 表達(dá)較單純KD 血清刺激組顯著降低( P ＜0.05) ，且下降幅度較丙種球蛋白干預(yù)組顯著( P ＜0.05) 。

圖2 各組NF-κB p65 的電泳灰度

表5 各組NF-κB p65mRNA 的相對IOD 值(±s)

表5 各組NF-κB p65mRNA 的相對IOD 值(±s)

與N 組比較，△P ＜0.05； 與K 組比較，◇P ＜0.05； 與G 組比較，* P ＜0.05

組別 n NF-κ B p65 mRNA N 組10 0.599 ±0.033 K 組 10 1.219 ±0.024△G 組 10 0.879 ±0.012 P 組 10 0.459 ±0.060◇＊

圖3 各組NF-κB p65mRNA 的相對IOD 值比較

3.Western blot 法檢測各組NF -κB p65 蛋白的相對表達(dá)：各組HUVEC 胞核內(nèi)的NF -κB p65 蛋白電泳灰度圖( 圖4) 及相對IOD 值表達(dá)( 表6，圖5) 。結(jié)果顯示：①KD 血清刺激下，NF -κB p65 蛋白的表達(dá)較對照組顯著增加( P ＜0.05) ； ②在丙種球蛋白干預(yù)下，KD 血清中NF -κB p65 蛋白的表達(dá)較單純KD 血清刺激組有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；③在PDTC 的預(yù)下，KD 血清中NF -κB p65 蛋白表達(dá)較單純KD 血清刺激組顯著降低( P ＜0.05) 。

圖4 各組HUVEC 中NF-κB p65、β-actin 蛋白的灰度

表6 各組HUVEC 中NF-κB p65 蛋白的相對IOD 值(±s)

表6 各組HUVEC 中NF-κB p65 蛋白的相對IOD 值(±s)

與N 組比較，△P ＜0.05；與K 組比較，◇P ＜0.05

組別 n NF-κB p65蛋白N 組10 0.195 ±0.068 K 組 10 0.526 ±0.128△G 組 10 0.479 ±0.072△P 組 10 0.172 ±0.135◇

圖5 各組HUVEC 中NF-κB p65 蛋白的相對IOD 值比較

討 論

川崎病臨床主要表現(xiàn)為發(fā)熱( ＞5 天) 、不規(guī)則皮疹、頸部淋巴結(jié)非化膿性腫大、眼結(jié)合膜炎、口唇皸裂、楊梅舌、掌( 跖) 紅斑、手足硬性水腫等，最嚴(yán)重的并發(fā)癥是冠狀動脈損害( CAL) ，表現(xiàn)為冠脈擴張或者冠脈瘤［1］，即使急性期未觀察到CAL，成人期發(fā)生缺血性心臟病的危險性仍然增加［7］。KD 的發(fā)病機制尚不完全清楚，但必然存在免疫系統(tǒng)的異常激活與炎性反應(yīng)的過度擴大。目前國際上較為認(rèn)可的假說是，某種或某類病原體感染特殊基因的敏感個體，發(fā)生免疫系統(tǒng)的異常激活與過度擴大的炎性反應(yīng)，進(jìn)而出現(xiàn)的一系列病理過程［2］。所以尋找KD 的炎性反應(yīng)核心環(huán)節(jié)，對KD 的發(fā)病機制和針對性治療都有重要意義。

NF-κB 是一種多極基因調(diào)控的轉(zhuǎn)錄蛋白，具有廣泛的生物學(xué)活性，在靜息狀態(tài)下，NF -κB 多以異二聚體的形式與IκB 結(jié)合存在于胞質(zhì)，激活后進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄功能，進(jìn)而直接或間接調(diào)控免疫炎性反應(yīng)相關(guān)的靶基因如細(xì)胞因子、趨化因子、協(xié)同刺激分子及黏附分子表達(dá)，從而出現(xiàn)機體一系列的炎性反應(yīng)表現(xiàn)，故認(rèn)為NF-κB 信號通路在炎性反應(yīng)中起到核心 作 用［8］。本 實 驗 通 過 檢 測 細(xì) 胞 內(nèi) NF - κB p65mRNA，細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65mRNA 蛋白的表達(dá)，能夠一定程度上反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)NF -κB 信號通路的激活程度。有研究發(fā)現(xiàn)急性期KD 患兒外周血的單核-吞噬細(xì)胞中的NF -κB 信號通路處于異常激活狀態(tài)，并且在發(fā)生冠脈損害( CAL) 的KD 患兒中更加顯著，提示該信號通路在KD 的發(fā)生上可能起到關(guān)鍵作用［9］。但由于每個KD 患兒病程、病情輕重存在差異，患兒外周血單核-吞噬細(xì)胞數(shù)量少，故實驗結(jié)果存在一定局限性。Saito 等［10］運用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，培育了E-DNIκB 模型小鼠，這種小鼠由于內(nèi)皮細(xì)胞中IκBα 蛋白不能被降解，NF-κB 蛋白不能被釋放進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)E-DNIκB 模型小鼠在行腹主動脈切開再縫合術(shù)后，發(fā)生腹主動脈瘤的比例較正常小鼠明顯減少，提示NF-κB 信號通路參與介導(dǎo)動脈壁細(xì)胞外基質(zhì)的病理性重構(gòu)，參與動脈瘤的形成，可能對KD 并發(fā)癥起到關(guān)鍵作用。

血管內(nèi)皮細(xì)胞是炎癥早期效應(yīng)靶向之一，能分泌多種炎性物質(zhì)，目前國內(nèi)外對血管內(nèi)皮細(xì)胞的NF -κB 信號通路研究有限，故本實驗選取的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞( HUVEC) 為研究細(xì)胞，實驗中筆者發(fā)現(xiàn)在川崎病血清的刺激下，HUVEC 細(xì)胞活力顯著下降，伴隨細(xì)胞內(nèi)NF-κB p65 mRNA 表達(dá)顯著增強，細(xì)胞核內(nèi)NF-κB 蛋白合成顯著增加，提示KD 患兒血清中某些物質(zhì)能促使細(xì)胞內(nèi)的NF-κB 信號通路過度激活，并造成細(xì)胞自身的損傷。人體中冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞位于血液與血管壁之間，如發(fā)生炎性介質(zhì)過度分泌，不僅造成細(xì)胞自身損害，還能引起周圍的血管基膜、內(nèi)彈力膜破壞，最終導(dǎo)致冠脈擴張和冠脈瘤等并發(fā)癥，故推測與KD 并發(fā)癥關(guān)系密切［11］。

盡管KD 發(fā)病機制尚未明確，但標(biāo)準(zhǔn)療法靜脈注射用人免疫球蛋白( IVIG)2g/kg 聯(lián)合阿司匹林口服方案的有效性已得到公認(rèn)，使繼發(fā)CAL 的發(fā)生率從自然病程的20% ～25%下降至3% ～5%［12］。IVIG 可從多方面對血管內(nèi)皮細(xì)胞起到保護(hù)作用，如封閉血液中單核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞或血小板表面受體，通過調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞功能，抑制炎性細(xì)胞黏附，中和病原體或毒素等［13～15］。本研究中在丙種球蛋白干預(yù)下，細(xì)胞活力較單純KD 血清刺激組顯著增強，伴隨HUVEC 細(xì)胞內(nèi)NF-κB p65 mRNA 表達(dá)和細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65 蛋白表達(dá)較均有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，原因可能由于IVIG 的作用是多方面的，對該通路的抑制作用效果有限，或由于樣本量較少導(dǎo)致的統(tǒng)計誤差。但徐明國等［16］的實驗結(jié)果顯示IVIG 也能起到對NF-κB 信號通路顯著抑制的作用，提示IVIG 抑制細(xì)胞NF -κB信號通路過度激活可能也是其藥理機制之一。

那么單純抑制細(xì)胞NF-κB 信號通路，是否可能對KD 的治療有效呢? 吡咯烷二硫氨基甲酸酯( PDTC) 是一種強氧化劑，能通過抑制單核細(xì)胞-吞噬細(xì)胞浸潤和抑制一氧化氮合酶( iNOS) 表達(dá)，直接或間接抑制反應(yīng)性氧中間體( ROIs) 的產(chǎn)生等途徑抑制IκB 蛋白降解，減少NF - κB 的核移位，起到對NF-κB 信號通路特異性抑制作用［17］。本實驗中在PDTC 的干預(yù)下，HUVEC 細(xì)胞活力較單純KD 血清刺激組顯著增強，伴隨細(xì)胞內(nèi)NF -κB p65 mRNA 和細(xì)胞核內(nèi)NF - κB p65 蛋白的表達(dá)均顯著下降，提示PDTC 對在抑制NF -κB 信號通路的作用效果強于IVIG，并且對體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞也能起到和IVIG相近的保護(hù)作用。國外的研究還證實，PDTC 還能增強心肌梗死后心肌細(xì)胞對缺血再灌注損傷的耐受力，起到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。推測其有減輕冠脈擴張等并發(fā)癥的作用，故說明PDTC 在KD 的治療上有潛質(zhì)的臨床價值。但是在本實驗中，筆者還發(fā)現(xiàn)由于PDTC 對NF-κB 信號通路強力的抑制作用，本實驗中P 組NF-κB 蛋白表達(dá)水平甚至低于正常組。有實驗研究證實，生物體內(nèi)NF-κB 信號通路的作用廣泛、調(diào)控精細(xì)，在炎性反應(yīng)早期，可能起到保護(hù)作用，還對內(nèi)皮細(xì)胞的其他正常生理功能也起重要作用，故只有能做到對NF-κB 信號通路的精確調(diào)控，特異性的抑制性藥物才可能試用于臨床［18］。

綜上所述，本研究證明HUVEC 在KD 血清刺激下，細(xì)胞中NF-κB 信號通路被激活，造成細(xì)胞自身損害，推測與KD 的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。比較IVIG和PDTC 在體外HUVEC 的干預(yù)效果，證明PDTC 能通過抑制細(xì)胞核內(nèi)NF - κB 蛋白的過度合成，增強HUVEC 對抗KD 血清的刺激，起到和IVIG 相近的保護(hù)作用，在KD 的治療上有潛在的臨床價值。同時應(yīng)注意到人體內(nèi)NF -κB 信號通路具有十分精細(xì)和復(fù)雜的調(diào)節(jié)機制，過度抑制很可能干擾正常生理功能，如何進(jìn)行適度的抑制需要開展更深入的研究。

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