外周血單一核細胞的體外活化對成纖維細胞增殖和基質金屬蛋白酶產生的影響

康玉英 孫彩虹 鞠梅 陳崑 顧恒

膠原是皮膚組織細胞外結構中最豐富的成分，基質金屬蛋白酶（MMP）是一組與膠原降解有關的酶，其中MMP-1、3、9這三種酶協同作用可完全降解皮膚膠原，被認為與光老化關系最為密切［1-2］。紫外線可誘導成纖維細胞表達或分泌MMP［3］，而對皮膚組織中炎癥浸潤細胞在光老化中的作用研究較少，僅發現肥大細胞、巨噬細胞、內皮細胞、中性粒細胞、淋巴細胞數目在曝光部位增多［4-5］。為進一步探討炎癥細胞是否直接或間接促進MMP增高或活性增加，我們對被活化的外周血單一核細胞（PBMC）及其活化產物刺激培養的成纖維細胞進行研究，探討炎癥細胞在光老化中的作用。

材料與方法

一、材料

1.標本來源：原代人皮膚成纖維細胞取自中國醫學科學院皮膚病研究所兒童眼瞼手術后皮膚組織，PBMC取自3例健康志愿者。本研究獲中國醫學科學院皮膚病醫院倫理委員會批準，患兒家長及所有志愿者均簽署知情同意書。

2.主要試劑和儀器：鼠抗人MMP-1、MMP-3、MMP-9、白細胞介素（IL）-6 ELISA檢測試劑盒為武漢USCN LIFE公司產品，RNA抽提試劑TRIzol（美國Invitrogen公司），反轉錄試劑盒（美國Promega公司），DL 2000 DNA標準參照物［寶生物工程（大連）有限公司］，植物血凝素（PHA）（上海伊華公司），兔抗人多克隆CD3抗體、CD28抗體（北京博奧森生物技術有限公司），噻唑藍（MTT）（美國Sigma公司），RPMI 1640培養基、DMEM培養基（美國Gibco公司）。CO2孵箱（日本Espec公司），GeneAmp PCR System 2700（美國ABI公司），JS-380A自動凝膠圖像分析儀（上海培清科技有限公司），Transwell培養板（美國Costar公司），DG-3022A酶聯免疫檢測儀（南京華東電子集團公司）。

二、方法

1.分離、活化 PBMC：參照文獻［6-7］，無菌條件下采集健康志愿者新鮮抗凝外周血10 ml，于4 h內用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單一核細胞。接種至96孔培養板中，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基調整細胞至2×106/ml，分3組加入不同活化劑，使淋巴細胞活化：對照組不加活化劑，PHA組用含100 mg/L PHA刺激，雙抗體組用含2 mg/L CD3及5mg/LCD28雙抗體刺激，每孔終體積200μl。于37℃、相對濕度95%、5%CO2孵箱中培養72 h，收集上清液。

2.MTT法檢測PBMC增殖活性：處理細胞、分組同上，每組設3個復孔，在培養（72 h）結束前4 h每孔加入MTT 20 μ（l5 g/L），繼續培養4 h后棄去孔內培養基，加入 150 μl二甲基亞砜（DMSO），低速振蕩10 min，酶聯免疫檢測儀550 nm處測定各孔A值。

3.酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測PBMC活化后上清液 IL-6、MMP-1、MMP-3、MMP-9 蛋白含量：收集活化、培養72 h后PBMC的上清液，分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔、陰性對照孔（RPMI 1640培養基），按照ELISA試劑盒說明書操作，450 nm處測定各孔A值。運用CurveExpert1.3軟件繪制標準曲線及擬合方程，計算待測樣品的含量。

4.半定量反轉錄（RT）-PCR法檢測PBMC活化后MMP-1、MMP-3、MMP-9 mRNA的表達：同上處理細胞、分組，每組10孔，培養24 h，收集PBMC，根據Trizol試劑說明書操作，提取總RNA，以β肌動蛋白基因為參照標準，引物由ABI公司的Primer Express Software v2.0設計，由生工生物工程（上海）服務有限公司合成。引物序列：β肌動蛋白正向引物5′-CACCTTCTACAATGAGCTGC-3′，反向 5′-AGGC AGCTCGTAGCTCTTCT-3′，擴增片段長度466 bp；MMP-1正向引物 5′-CTGAAGGTGATGAAGCAGC C-3′，反向 5′-AGTCCAAGAGAATGGCCGAG-3′，擴增片段長度428 bp；MMP-3正向引物5′-CTCACAG ACCTGACTCGGTT-3′，反向 5′-C ACGCCTGAAGG AAGAGATG-3′，擴增片段長度 294 bp；MMP-9 正向引物 5′-CGCAGACATCGTCATCCAGT-3′，反向 5′-GGATTGGCCTTGGAAGATGA-3′，擴增片段長度406 bp。反轉錄反應參數42℃15 min、95℃5 min、4℃5 min。PCR反應參數：95℃預變性5 min，95℃變性 30 s，58℃退火 45 s，72℃延伸 1 min，35個循環，72℃延伸7 min，4℃保存。取PCR擴增產物3 μl在15 g/L瓊脂糖凝膠中（含0.5 mg/L溴化乙錠）電泳，于自動凝膠圖像分析儀上掃描灰度值，以β肌動蛋白作內參，計算mRNA的相對表達水平。每組樣本重復3次。

5.MTT法檢測不同稀釋度PBMC活化后上清液（即CM）對培養的成纖維細胞增殖活性的影響：同前方法分離、活化PBMC并收集CM，-20℃保存備用。參考文獻［8］分離、培養人皮膚成纖維細胞，取第3～10代對數生長期人皮膚成纖維細胞，按5×104/ml密度接種至 96孔板，每孔100 μl，待細胞貼壁后（約10 h）分別加入不同體積的3組CM，分別為對照刺激組、雙抗體刺激組、PHA刺激組，終體積為 200 μl，每組 CM 最終稀釋度分別為 1/2、1/5、1/10、1/20，同時設不加CM組（對照組），共13組，每組設3個復孔。培養48h，培養結束前4h加入MTT20μl，同方法2測定各孔A值。

6.ELISA法檢測不同稀釋度CM對成纖維細胞分泌MMP-1、MMP-3、MMP-9蛋白的影響：同方法5將成纖維細胞接種至96孔板，每孔100 μl，待細胞生長融合達90%時吸棄培養基，換用無血清DMEM培養基，過夜，吸棄培養基，加入無血清DMEM培養基及不同體積的3組CM，終體積為200 μl，CM最終稀釋度分別為1/2、1/5、1/10，同時設不加CM組（對照組），共10組，每組設3個復孔，培養48h，收集上清液，最后同3組原液CM一起檢測，共13組，同方法3用ELISA法檢測各組細胞上清液中 MMP-1、MMP-3、MMP-9蛋白含量。

7.半定量RT-PCR法檢測不同組CM對成纖維細胞表達MMP-1、MMP-3、MMP-9 mRNA的影響：同方法5將成纖維細胞接種至6孔板，每孔3 ml，待細胞生長融合達90%時吸棄培養基，換用無血清DMEM培養基，過夜，吸棄培養基，加入2.4 ml無血清DMEM培養基及600 μl不同CM原液，同時設對照組加入無血清DMEM培養基3 ml，培養24 h，吸棄上清液，各孔加入TRIzol 1 ml，反復吹打，使細胞完全融解，根據Trizol試劑說明書操作，提取總RNA，同方法4檢測成纖維細胞MMP-1、MMP-3、MMP-9 mRNA 的相對表達水平。每組樣本重復3次。

結 果

一、不同處理組PBMC的增殖活性及CM中IL-6、MMP-1、MMP-3、MMP-9 蛋白含量比較

不同活化劑刺激PBMC后，PHA組、雙抗體組、對照組之間 PBMC 增殖活性（A550）（F=8.507，P＜0.05）及上清液中 IL-6（F=5.692，P＜ 0.05）、MMP-3含量（F=6.098，P＜0.05）差異均有統計學意義。進一步兩兩比較，PHA組較對照組增殖活性及分泌IL-6、MMP-3水平明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05）（表1）。3組上清液中均未檢測到MMP-1、MMP-9蛋白（A值為0.00至0.09不等）。

二、不同處理組 PBMC MMP-1、MMP-3、MMP-9 mRNA表達

活化劑刺激PBMC后可表達MMP-1 mRNA，但不表達MMP-3 mRNA（圖1）或MMP-9 mRNA（圖中未標出）。經Games-Howell檢驗兩兩比較，對照組、雙抗體組、PHA組間PBMC表達MMP-1 mRNA水平差異有統計學意義（均P＜0.05），見表1。

三、不同稀釋度CM對成纖維細胞增殖活性的影響

單因素方差分析顯示，1/2、1/5、1/10、1/20 CM 刺激后對照刺激組、雙抗體刺激組、PHA刺激組、對照組組間成纖維細胞增殖活性（A值）比較，差異均無統計學意義；對照刺激組、雙抗體刺激組、PHA刺激組各組內 1/2、1/5、1/10、1/20 CM 刺激后細胞增殖活性比較，差異均無統計學意義。見表2。

表1 不同處理組PBMC增殖活性（A550值）、上清液中IL-6和MMP-3含量、MMP-1 mRNA的相對表達水平（±s）

表1 不同處理組PBMC增殖活性（A550值）、上清液中IL-6和MMP-3含量、MMP-1 mRNA的相對表達水平（±s）

注：n=3。a：與對照組比較，P ＜ 0.05；b：與雙抗體組比較，P ＜ 0.05。PBMC：外周血單一核細胞；IL：白細胞介素；MMP：基質金屬蛋白酶

組別 增殖活性 I L-6（μ g/L） M M P-3（m g/L） M M P-1 m R N A對照組 0.3 7 0±0.0 5 6 0.9 8 6±0.1 0 7 6.5 6 7±2.1 2 2 0.0 8 3±0.0 1 6雙抗體組 0.4 7 0±0.1 2 8 1.1 3 5±0.1 9 3 7.3 1 8±2.3 8 1 0.1 8 8±0.0 3 0 a植物血凝素組 0.6 5 0±0.0 4 4 a 1.5 7 3±0.3 8 4 a 1 2.6 7 0±2.4 8 5 a 0.7 1 4±0.1 0 4 ab

圖1 不同處理組外周血單一核細胞基質金屬蛋白酶（MMP）-3、MMP-1 mRNA 表達結果 1、4、7：MMP-3（294 bp）；2、5、8：MMP-1（428 bp）；3、6、9：β肌動蛋白（466 bp）。1～3：雙抗體刺激組；4～6：PHA刺激組；7～9：對照刺激組；10：陰性對照組；M：DNA標準參照物

表2 不同稀釋度條件培養基（CM）刺激后成纖維細胞增殖活性（A550值，±s）

表2 不同稀釋度條件培養基（CM）刺激后成纖維細胞增殖活性（A550值，±s）

注：n=3。同一稀釋度下不同組間及同一組內不同稀釋度間比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）

C M稀釋度組別F值 P值1/2 1/5 1/1 0 1/2 0對照組 0.2 7±0.0 2 5對照刺激組 0.2 7±0.0 3 6 0.2 8±0.0 1 2 0.2 6±0.0 1 0 0.2 5±0.0 1 5 0.7 3 0 ＞0.0 5雙抗體刺激組 0.2 9±0.0 5 0 0.2 4±0.0 5 3 0.2 5±0.0 3 2 0.2 6±0.0 5 1 0.6 9 5 ＞0.0 5 P H A刺激組 0.2 4±0.0 1 5 0.2 4±0.0 2 6 0.2 4±0.0 5 5 0.2 6±0.0 3 2 0.2 2 0 ＞0.0 5 F值 1.3 8 1 0.9 8 7 0.4 1 4 0.0 8 8 P值 ＞0.0 5 ＞0.0 5 ＞0.0 5 ＞0.0 5

四、不同稀釋度CM對成纖維細胞分泌MMP-1、MMP-3、MMP-9蛋白的影響

不同稀釋度CM刺激成纖維細胞后上清液中可檢測到MMP-3蛋白，以原液CM中含量最高，1/10CM刺激時最低；在相同的稀釋度刺激時，上清液中MMP-3含量以PHA刺激組最高，對照刺激組最低。經單因素方差分析，原液CM及1/5、1/10 CM刺激后對照刺激組、雙抗體刺激組、PHA刺激組組間上清液中MMP-3含量差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），1/2 CM刺激后，3組間MMP-3含量差異無統計學意義（P＞0.05）；進一步兩兩比較顯示，原液CM、1/10 CM時PHA刺激組較對照刺激組MMP-3水平明顯增加，差異均有統計學意義（均P＜0.05），PHA刺激組與雙抗體刺激組比較，差異無統計學意義（均P＞0.05）；1/5 CM時PHA刺激組較對照刺激組、雙抗體刺激組MMP-3水平均明顯增加，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；原液 CM、1/5 CM、1/10 CM時，對照刺激組與雙抗體刺激組比較，MMP-3含量差異無統計學意義（均P＞0.05）。見表3。而未受CM刺激的成纖維細胞上清液中未檢測到MMP-3蛋白（A450值為0），不同稀釋度CM刺激及未受CM刺激的成纖維細胞上清液中未檢測到MMP-1或MMP-9蛋白（A450值為0.00至0.09不等）。

五、不同組CM對成纖維細胞MMP-1、MMP-3、MMP-9 mRNA表達的影響

對照組及不同刺激組成纖維細胞MMP-1、MMP-3 mRNA均有表達（圖2），4組間比較MMP-1、MMP-3 mRNA表達水平差異無統計學意義（均P＞0.05），見表4。但各組均無MMP-9 mRNA表達。

表3 條件培養基（CM）原液以及不同稀釋度CM刺激成纖維細胞后上清液中MMP-3含量比較（mg/L，± s）

表3 條件培養基（CM）原液以及不同稀釋度CM刺激成纖維細胞后上清液中MMP-3含量比較（mg/L，± s）

注：n=3。a：與對照刺激組比較，P＜0.05；b：與雙抗體刺激組比較，P＜0.05。MMP：基質金屬蛋白酶

組別 C M 1/2 C M 1/5 C M 1/1 0 C M對照刺激組 6.2 4±2.0 0 3.0 5±0.8 0 1.1 1±0.4 6 0.4 0±0.1 2雙抗體刺激組 6.7 9±1.9 8 4.0 7±1.8 9 1.2 8±0.3 6 0.6 0±0.0 0植物血凝素刺激組 1 2.1 2±2.6 2 a 8.7 8±3.7 6 2.5 6±0.1 7 ab 0.7 3±0.1 2 a F值 6.4 1 5 4.5 9 7 1 5.4 3 0 8.6 4 2 P值 ＜0.0 5 ＞0.0 5 ＜0.0 1 ＜0.0 5

圖2 不同處理組成纖維細胞基質金屬蛋白酶（MMP）-1、MMP-3 mRNA 表達檢測結果 2、5、8、11：β 肌動蛋白（466 bp）；3、6、9、12：MMP-1（428 bp）；4、7、10、13：MMP-3（294 bp）。1：陰性對照；2 ～ 4：對照組；5～7：對照刺激組；8～10：植物血凝素（PHA）刺激組；11～13：雙抗體刺激組；M：標準參照物

表4 不同處理組成纖維細胞基質金屬蛋白酶（MMP）-1、MMP-3 mRNA的相對表達水平（±s）

表4 不同處理組成纖維細胞基質金屬蛋白酶（MMP）-1、MMP-3 mRNA的相對表達水平（±s）

注：n=3。4組成纖維細胞MMP-1、MMP-3 mRNA表達水平差異無統計學意義（均P＞0.05）

組別 M M P-1 m R N A M M P-3 m R N A對照組 1.1 3 6±0.0 8 8 0.9 9 1±0.3 1 4對照刺激組 0.9 7 8±0.1 3 0 1.0 0 3±0.2 0 6雙抗體刺激組 0.9 4 7±0.2 6 4 0.8 8 8±0.1 2 7植物血凝素刺激組 1.2 3 1±0.2 2 3 0.9 6 3±0.0 8 4 F值 1.4 9 1 0.1 9 6 P值 ＞0.0 5 ＞0.0 5

討 論

近年來炎癥細胞在光老化中的作用逐漸受到研究者的關注。Bosset等［4］和 Hase 等［5］研究顯示，皮膚組織中肥大細胞、巨噬細胞、內皮細胞、中性粒細胞、淋巴細胞數目在曝光部位增多，曝光部位皮膚MMP-1染色陽性的T淋巴細胞數顯著增加。我們既往研究亦證實，曝光部位淋巴細胞、單核巨噬細胞數目顯著高于非曝光部位，且淋巴細胞數增加與光照射累積相關［9］。有關炎癥細胞在光老化中的作用機制以及對MMP影響的進一步研究顯示，巨噬細胞可以分泌MMP-1［10］，肥大細胞能分泌激活MMP-1的蛋白酶［11］，T 淋巴細胞可表達 MMP-2、MMP-9、MMP-10、MMP-13（膠原酶 3）［12-14］。這些研究直接或間接證明炎癥浸潤細胞可分泌或激活某些MMP，參與光老化過程。

經典的PBMC活化劑包括PHA、刀豆素A等，為多克隆激活劑，不涉及抗原的特異性。而T淋巴細胞活化過程需要第一、二信號，涉及細胞表面抗原CD3、CD28的激活，近年以CD3、CD28抗體作為淋巴細胞激活劑的研究較多［15］。淋巴細胞活化后可分泌 IL-6、干擾素（IFN）-γ、腫瘤壞死因子（TNF）等［16］，而 IL-1α、IL-6 等可誘導成纖維細胞分泌MMP-1、MMP-3［17-18］，考慮到 IL-6 作為淋巴細胞活化后產物可能參與誘導成纖維細胞分泌MMP，故將IL-6作為淋巴細胞活化的檢測指標之一，但隨后的淋巴細胞活化后產物（包含IL-6）刺激成纖維細胞實驗未發現其顯著的刺激作用，所以IL-6對MMP的刺激作用未作深入研究。

本研究分別以非特異性活化劑PHA及特異性活化劑CD3、CD28雙抗體作為刺激劑，同時以含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基作為對照，觀察PBMC活化情況。MTT法檢測PBMC增殖活性，發現PHA刺激組細胞活性最高，同時該組活化24 h后MMP-1 mRNA表達最高，活化后上清液中IL-6、MMP-3濃度亦最高，提示細胞增殖明顯者MMP-1 mRNA表達水平及分泌IL-6、MMP-3水平高，而對照組細胞增殖活性、MMP-1 mRNA表達水平及分泌IL-6、MMP-3 水平最低，CD3、CD28 雙抗體刺激組上述檢測值介于二者之間，這與雷其洪等［19］對T淋巴細胞增殖轉化的研究一致，即PHA刺激后細胞的增殖指數高于 CD3、CD28 抗體刺激者。Hase 等［5］發現，曝光部位皮膚MMP-1染色陽性的T淋巴細胞數顯著增加，在一定條件下培養的T淋巴細胞表達MMP-1 mRNA，與我們的結果一致。但是在活化后上清液中各組均未檢測到MMP-1蛋白，同樣在培養的成纖維細胞上清液中亦未檢測到MMP-1蛋白，但可檢測到MMP-1 mRNA表達，可能為檢測方法不當或靈敏度太低有關，確切原因有待進一步研究。

同時，我們在PBMC CM中可以檢測到MMP-3蛋白，且濃度較高。采用不同稀釋度的CM刺激成纖維細胞后其上清液中MMP-3蛋白含量隨著CM的稀釋而減少，且均低于原液CM。同時RPMI 1640培養基及不加CM的成纖維細胞上清液中均未檢測到MMP-3蛋白，表明MMP-3為PBMC活化后產物，CM刺激成纖維細胞后上清液中MMP-3為CM中MMP-3稀釋而非成纖維細胞分泌所致，而且CM刺激成纖維細胞后各組MMP-1、MMP-3 mRNA表達水平無顯著性差異，表明CM對成纖維細胞的MMP-1、MMP-3 mRNA表達無影響，但不同刺激組PBMC活化后均未檢測到MMP-3 mRNA表達。Fisher等［20］報道，紫外線照射人皮膚后 MMP-8 蛋白水平升高并伴隨中性粒細胞浸潤，但MMP-8 mRNA無表達，用糖皮質激素氯倍他索預處理可顯著阻斷該過程，表明紫外線照射使中性粒細胞脫顆粒釋放預先存在的MMP-8蛋白，從而使皮膚中MMP-8蛋白水平升高，而不是新合成MMP-8。本研究中PBMC活化后上清液中可檢測到MMP-3蛋白但無MMP-3 mRNA表達，是否與該研究中MMP-8升高的機理類似有待進一步深入研究。

有報道顯示，對體外培養的成纖維細胞加入細胞因子 TNF-α、IL-1β、IL-10 后上清液中 MMP-1、-3、-9 濃度均增加［21］，將急性心肌梗死患者的PBMC體外培養24 h后MMP-9 mRNA表達及蛋白水平均增加2倍［22］。而我們在PBMC活化后上清液及培養的成纖維細胞上清液中均未檢測到MMP-9蛋白，且在不加及加入 CM 24、36、48、72 h后均未檢出，同時在MMP-9 mRNA表達實驗中對不同的PCR引物、退火溫度進行了摸索，但MMP-9 mRNA表達均為陰性（因結果陰性未列出），是否為刺激條件、實驗方法等不同導致MMP-9在培養的PBMC、成纖維細胞中表達陰性仍需進一步研究。

本研究對PBMC進行體外活化，可檢測到MMP-3蛋白及MMP-1 mRNA表達，但PBMC活化后上清液不能刺激成纖維細胞分泌MMP-1、MMP-3、MMP-9 蛋 白 及 表 達 MMP-1、MMP-3 mRNA，表明炎癥細胞可能通過自身產生MMP而不是作用于成纖維細胞發揮作用。我們的研究顯示，PBMC體外活化后可以表達MMP-1 mRNA及分泌MMP-3蛋白，下一步我們將使用紫外線照射PBMC，以觀察紫外線照射下PBMC的活化、MMP表達等情況，進一步明確炎癥浸潤細胞在光老化中的作用以及分子機制。

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