自行制備的HPV6b和11型E7蛋白多克隆抗體檢測尖銳濕疣皮損的研究

曹蕾 程浩 王惠 周強 湯怡 姜少杰 丁楊 陳賢禎

尖銳濕疣多由低危型人乳頭瘤病毒6型（HPV-6）和 11 型（HPV-11）感染引起［1］。由于病原學(xué)檢測的實驗室要求高，難以在臨床尤其基層醫(yī)院進行，造成不典型皮損的尖銳濕疣易誤診或漏診。本研究采用自主研發(fā)制備的HPV6b和11型E7蛋白多克隆抗體對55例外陰尖銳濕疣皮損進行免疫組化檢測，探討檢測這兩種抗體的臨床意義。

材料與方法

一、材料

1.臨床資料：收集杭州市富陽區(qū)第一人民醫(yī)院皮膚科2013年9月至2014年10月間確診的55例尖銳濕疣皮損標(biāo)本。男20例，女35例，年齡17～65（34.07±14.26）歲。53例為首診病例，2例為復(fù)發(fā)病例。皮損數(shù)目不等，女性多分布于外陰，男性多分布于包皮和龜頭。皮損表現(xiàn)典型，多為雞冠或菜花狀皮疹，醋酸白試驗陽性。皮損活檢病理可見典型的尖銳濕疣改變［2］。

2.主要試劑：免疫組化所用一抗HPV6b和11型E7蛋白兔多克隆抗體由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院皮膚科和生物醫(yī)學(xué)研究中心自行研發(fā)制備。二抗為兔鼠混合型試劑盒（美國Invitrogen公司）。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）所用試劑為DL2000 DNA Marker［寶生物工程（大連）有限公司］，瓊脂糖（西班牙Biowest公司），Trizol（美國Invitrogen公司），Taq酶mix（美國Promega公司），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

二、方法

1.標(biāo)本處理：局麻下用血管鉗夾取部分疣體組織，生理氯化鈉液沖洗后置入4%甲醛固定，常規(guī)組織病理檢查，HE染色。其中18例同時取疣體-80℃冰凍保存。

2.免疫組化染色：55份尖銳濕疣皮損標(biāo)本分別進行HPV6b和11型E7蛋白多克隆抗體免疫組化EnVision法染色：121℃高壓修復(fù)抗原，室溫下一抗（HPV6b和11型E7蛋白抗體稀釋度分別為1∶1 000和1∶500）孵育60～90 min，二抗羊抗鼠/兔 IgG 孵育30 min，DAB色源底物溶液孵育1～3 min，其余步驟按試劑盒說明書操作。

3.結(jié)果觀察和分析：鏡下觀察細(xì)胞染色情況，結(jié)合陽性細(xì)胞所占百分比和染色強度進行分析。每視野下染色陽性細(xì)胞所占皮損表皮細(xì)胞總數(shù)的百分比評定：陰性為0分，陽性細(xì)胞數(shù)≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。染色強度評定：陰性為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。根據(jù)兩項評分之乘積判斷結(jié)果：≤ 1為陰性（-），2～3為弱陽性（+），4～5為中度陽性（++），≥6為強陽性（+++），且認(rèn)定+～+++為陽性表達(dá)［3-4］。每張HPV6b或11型E7陽性表達(dá)的免疫組化切片均在高倍鏡（×400）下隨機選取5個視野，計算每個視野中表皮各層HPV6b、11型E7蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)與各層細(xì)胞總數(shù)之比，取均數(shù)為表皮各層陽性表達(dá)細(xì)胞分布密度。

4.RT-PCR檢測E7蛋白mRNA表達(dá)：設(shè)計檢測HPV6b及11型E7基因的引物。HPV6b型E7基因引物（297 bp），正向 5′-ATGCATGGAAGACATGT TACCC-3′，反向 5′-TTAGGTCTTCGGTGCGCAGA T-3′；HPV11 型 E7 基因引物（297 bp），正向 5′-ATG CATGGAAGACTTGTTACCC-3′，反向 5′-TTATGGT TTTGGTGCGCAGATG-3′；GAPDH 引物（402 bp），正向 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTCA-3′；反向 5′-T TCACACCCATGACGAACAT-3′。Trizol一步法提取標(biāo)本RNA，并通過紫外分光光度計測定濃度和純度，經(jīng)RT-PCR獲得的產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像儀拍照分析。

5.統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS17.0軟件，數(shù)據(jù)分別采用χ2檢驗、單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、HPV6b和11型E7抗體免疫組化法檢測尖銳濕疣皮損

免疫組化染色顯示（圖1），HPV6b和11型E7蛋白為表皮細(xì)胞胞核表達(dá)，均表現(xiàn)為胞核中棕黃色或棕褐色顆粒。55例尖銳濕疣皮損中HPV6b和11型E7蛋白總陽性表達(dá)52例（94.55%），兩型E7蛋白雙陽性表達(dá)22例（40.00%），見圖1，兩蛋白均陰性表達(dá)3例（5.45%）。HPV6b和11型E7蛋白陽性表達(dá)分別為42例（76.36%）和32例（58.18%），HPV6b型E7蛋白抗體陽性率顯著高于HPV11型E7蛋白抗體（χ2=16.764，P=0.001）。兩蛋白在皮損表皮全層均有陽性表達(dá)，但基底層細(xì)胞表達(dá)較多，棘層細(xì)胞次之，顆粒層細(xì)胞最少，兩型E7蛋白在表皮各層陽性表達(dá)的細(xì)胞分布密度差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001）。見表 1。

二、RT-PCR檢測HPV6b、11型E7 mRNA在尖銳濕疣皮損的表達(dá)

采用RT-PCR對18例尖銳濕疣冰凍標(biāo)本皮損中HPV6b、11型E7 mRNA表達(dá)進行檢測，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可顯示297 bp處明顯的電泳條帶，分子量與E7基因一致，提示HPV6b或11型E7 mRNA表達(dá)陽性。HPV6b和11型 E7 mRNA陽性表達(dá)分別為15例和10例，其中雙陽性表達(dá)7例（圖2）。RT-PCR法檢測HPV6b和11型E7蛋白表達(dá)型別與免疫組化結(jié)果一致，符合率均為100%，且雙陽性表達(dá)結(jié)果也完全一致。

圖1 自制HPV6b和11型E7多克隆抗體免疫組化法檢測同一份尖銳濕疣皮損（免疫組化EnVision法×100） 1A、1B：同一份尖銳濕疣皮損兩型E7蛋白均表達(dá)陽性；1C、1D：同一份尖銳濕疣皮損HPV6b型E7蛋白陽性表達(dá)（1C），HPV11型E7蛋白表達(dá)陰性（1D）；1E、1F：同一份尖銳濕疣皮損HPV6b型E7蛋白表達(dá)陰性（1E），HPV11型E7蛋白表達(dá)陽性（1F）

討 論

HPV早期基因編碼的E7蛋白在HPV感染進程中通過多種途徑發(fā)揮作用。本實驗所用HPV6b和11型E7蛋白多克隆抗體是將自行構(gòu)建表達(dá)并純化的E7蛋白免疫新西蘭兔后獲得的兔多克隆抗體IgG，經(jīng)Western印跡及免疫熒光鑒定，該兔抗IgG具有高效價性和抗HPV6b和11型E7蛋白特異性［5-6］。我們用這兩型抗體，采用免疫組化法檢測55份尖銳濕疣皮損標(biāo)本，兩抗體總陽性檢出率為94.55%，高于陳玨［7］和顏丹等［8］的原位雜交及 FQ-PCR 檢測結(jié)果。朱小霞等［9］用熒光定量PCR法檢測尖銳濕疣皮損HPV6和11型，結(jié)果與本實驗相似。本實驗中兩蛋白陽性檢出率不同，有22份標(biāo)本為HPV6b和11重疊感染，提示兩型抗體無交叉反應(yīng)。18例皮損組織通過RT-PCR法檢測發(fā)現(xiàn)，HPV6b和11型的E7 mRNA陽性表達(dá)及型別與免疫組化結(jié)果完全一致，提示該兩型抗體對尖銳濕疣皮損HPV6b、11的免疫組化檢測敏感性好，特異性強，與尖銳濕疣臨床診斷符合率高。有3例檢測結(jié)果陰性，考慮有可能為HPV其他型感染。金納等［10］用 HPV6 和 11 型 E6 基因引物介導(dǎo)PCR法檢測發(fā)現(xiàn)，HPV11型明顯多于 6b型，與本實驗結(jié)果有一定差異，可能與受檢人群的差異及檢測方法不同有關(guān)。

表1 尖銳濕疣皮損組織HPV6b和11型E7蛋白在表皮各層陽性表達(dá)細(xì)胞分布（%，±s）

表1 尖銳濕疣皮損組織HPV6b和11型E7蛋白在表皮各層陽性表達(dá)細(xì)胞分布（%，±s）

注：a：表皮各層陽性表達(dá)細(xì)胞分布比較

H P V亞型 例數(shù) 基底層 棘層 顆粒層 F值a P值6 b 4 2 4 1.9 3 7±2 4.1 7 4 2 3.7 3 2±1 6.8 2 8 7.3 8 2±9.2 2 2 8 6.3 1 3 ＜0.0 0 1 1 1 3 2 2 7.7 9 6±2 5.8 8 5 1 9.0 3 6±2 1.4 9 8 5.6 6 2±1 2.5 5 5 3 4.0 6 3 ＜0.0 0 1

圖2 尖銳濕疣皮損中HPV6b、11型E7 mRNA RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳圖 M：DL2000 DNA Marker；1～ 18：尖銳濕疣皮損標(biāo)本

我們發(fā)現(xiàn)，HPV6b和11型E7蛋白在皮損表皮全層細(xì)胞均有陽性表達(dá)，但基底層細(xì)胞較多，棘層次之，顆粒層最少，提示用這兩型抗體進行的免疫組化檢測可非常直觀地觀察到HPV6b和11感染細(xì)胞。余俐等［11］用原位雜交和殼抗原免疫組化法檢測尖銳濕疣皮損，發(fā)現(xiàn)兩方法的陽性細(xì)胞主要位于表皮淺層，與本實驗結(jié)果有一定差異。我們分析可能原因有：①原位雜交檢測HPV DNA而非蛋白的表達(dá)；②病毒感染基底層細(xì)胞進行DNA復(fù)制，并隨著細(xì)胞分化進入表皮淺層，而E7和L1蛋白分別與HPV早期和晚期蛋白有關(guān)。但確切原因還需增加樣本量作進一步研究。

綜上，本研究采用自行制備的HPV6b和11型E7蛋白抗體免疫組化法檢測尖銳濕疣皮損，檢測結(jié)果直觀，可以觀察到HPV6b和11型感染細(xì)胞在病損中的分布位置。檢測方法簡便易行，便于在有病理科的基層醫(yī)院開展。

［1］Crow JM.HPV:The global burden［J］.Nature,2012,488（7413）:S2-S3.

［2］中華醫(yī)學(xué)會皮膚性病學(xué)分會性病學(xué)組,中國醫(yī)師協(xié)會皮膚科分會性病亞專業(yè)委員會.尖銳濕疣診療指南（2014）［J］.中華皮膚科雜志,2014,47（8）:598-599.

［3］Zhou XD,Yu JP,Liu J,et al.Overexpression of cellular FLICE-inhibitory protein（FLIP）in gastric adenocarcinoma［J］.Clin Sci（Lond）,2004,106（4）:397-405.

［4］Massi D,Tarantini F,Franchi A,et al.Evidence for differential expression of Notch receptors and their ligands in melanocytic nevi and cutaneous malignant melanoma［J］.Mod Pathol,2006,19（2）:246-254.

［5］湯怡,周強,王琦,等.人乳頭瘤病毒6b型E7蛋白的原核表達(dá)及多克隆抗體制備［J］.病毒學(xué)報,2011,27（5）:416-420.

［6］丁楊,姜少杰,陳賢禎,等.11型HPV E7蛋白的表達(dá)及其多克隆抗體的制備［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2014,30（6）:618-622.

［7］陳玨.原位雜交和免疫組化技術(shù)檢測尖銳濕疣的比較［J］.中國皮膚性病學(xué)雜志,2010,24（9）:868-870.

［8］顏丹,顏海英,李燎,等.FQ-PCR方法檢測女性CA患者HPV6、11和 HPV16、18的實驗研究［J］.中國婦幼保健,2007,22（9）:1217-1218.

［9］朱小霞,程浩,張行,等.熒光定量PCR檢測尖銳濕疣皮損Toll樣受體的表達(dá)水平［J］.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2011,31（6）:560-563.

［10］金納,姚曉紅,趙可佳,等.不同引物介導(dǎo)的聚合酶鏈反應(yīng)對人乳頭瘤病毒的快速檢測與分型［J］.中國綜合臨床,2007,23（3）:258-260.

［11］余俐,彭杰,彭杰青,等.尖銳濕疣的原位雜交組化和免疫組化對比研究［J］.中國皮膚性病學(xué)雜志,2004,18（4）:233-234.