榅桲總多酚的純化工藝及PTP1B 抑制作用研究

哈及尼沙，阿力木江·阿布力孜，阿米娜，阿吉艾克拜爾·艾薩*

1 新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院;2 中國(guó)科學(xué)院干旱區(qū)植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所，烏魯木齊 830011

榅桲(Cydonia oblonga Mill.)是薔薇科(Rosaceae)榅桲屬(Cydonia)植物榅桲的成熟果實(shí)［1］。榅桲有濃郁香味，酸甜，性溫?zé)o毒。榅桲在新疆民間被當(dāng)作水果、藥品及調(diào)料品使用，具有補(bǔ)身益心、增益精神力、助胃利水、止渴止咳、止血止瀉、開(kāi)胃等作用，相傳已有數(shù)百年應(yīng)用歷史［2］。據(jù)典籍記載及現(xiàn)代研究表明，榅桲具有較高的食用和藥用價(jià)值，是維吾爾醫(yī)常用藥材［3，4］。榅桲中主要有效成分是多酚類(lèi)化合物［5-7］，具有抗氧化、抗菌、抗炎和抗病毒等活性［8-12］。目前對(duì)榅桲中多酚類(lèi)物質(zhì)的提取、純化方面沒(méi)有發(fā)現(xiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

大孔樹(shù)脂為一種有機(jī)高聚物吸附劑，具有吸附、富集、分離不同母核結(jié)構(gòu)化合物的功能［13］。該方法具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、節(jié)省能源、成本低、產(chǎn)品純度高、不吸潮等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用于多酚類(lèi)成分的富集、純化有較好的效果［14］。

本研究從11 種大孔吸附樹(shù)脂中篩選出對(duì)榅桲總多酚具有良好吸附和解吸性能的樹(shù)脂，探索適宜的純化條件;同時(shí)對(duì)榅桲總多酚進(jìn)行PTP1B 抑制作用的研究，為合理開(kāi)發(fā)利用榅桲資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

榅桲采自新疆克州上阿圖什鄉(xiāng)，經(jīng)中科院新疆生態(tài)與地理研究所植物分類(lèi)研究室沈觀冕研究員鑒定為薔薇科榅桲屬植物榅桲(Cydonia oblonga Mill.)的果實(shí);HPD-100、HPD-300、HPD-450、HPD-750 型大孔吸附樹(shù)脂，上海五維化工科技有限公司;D101 型大孔吸附樹(shù)脂，上海摩速科學(xué)器材有限公司;D140、NKA-9、AB-8、X-5、DM130 型大孔吸附樹(shù)脂，南開(kāi)大學(xué)化工廠;ADS-17 型大孔吸附樹(shù)脂，山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司;沒(méi)食子酸對(duì)照品(批號(hào):110831-20120)，中國(guó)食品藥品檢定研究院;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

UV-2550 型紫外分光光度儀，日本島津;Buchi R-210 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士Buchi 公司;YP5120 型電子分析天平，上海光正醫(yī)療儀器有限公司;HH-4 型智能數(shù)顯恒溫水浴鍋，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;HZQ-F160 型全溫震蕩培養(yǎng)箱，金壇市萬(wàn)華實(shí)驗(yàn)儀器廠;SpectraMax MD5 型酶標(biāo)儀，美谷分子儀器有限公司;DZF-6020 型真空干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

精密稱(chēng)取沒(méi)食子酸對(duì)照品6.1 mg，加水溶解并定容至100 mL，搖勻，制成濃度為61 μg/mL 的對(duì)照品溶液。準(zhǔn)確吸取沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0 和4.0 mL 于25 mL 容量瓶中，加磷鉬鎢酸溶液1.0 mL，加蒸餾水14 mL，再用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min。以沒(méi)加對(duì)照品的溶液作為空白，在500～900 nm 波長(zhǎng)范圍光譜掃描，確定757 nm 處的最大吸收為檢測(cè)波長(zhǎng)，測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，濃度(C，μg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其線(xiàn)性回歸方程為A=0.1196C+0.0408，相關(guān)系數(shù)r=0.9993。結(jié)果表明，在沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為1.22～9.76 μg/mL 范圍內(nèi)吸光度和濃度保持較好的線(xiàn)性關(guān)系。

1.2.2 榅桲總多酚粗提物的制備

稱(chēng)取榅桲果實(shí)粉末約250 g，在乙醇體積濃度60%、料液比1∶40(g/mL)、提取時(shí)間1 h、溫度80 ℃的條件下回流提取2 次，合并提取液減壓濃縮至無(wú)乙醇味，干燥得粗多酚浸膏，加蒸餾水超聲溶解配制榅桲總多酚提取液(藥液質(zhì)量濃度為1.630 g/mL)，備用。

1.2.3 大孔吸附樹(shù)脂的預(yù)處理

分別稱(chēng)取AB-8、D-140、X-5、HPD-100、HPD-450、HPD-300、HPD-750、ADS-17、D-101、DM-130、NKA-9 型等11 種大孔吸附樹(shù)脂各3.0 g，分別加入30 mL 無(wú)水乙醇浸泡24 h，使其充分溶脹，用濕法裝柱。用無(wú)水乙醇以2 BV/h 的流速淋洗樹(shù)脂至流出液加入蒸餾水后不呈現(xiàn)白色渾濁為止，再用蒸餾水以同樣的流速洗至無(wú)醇味。然后用5% HCl 溶液以2 BV/h 流速通過(guò)樹(shù)脂并浸泡3 h，用蒸餾水洗至中性。再用2% NaOH 溶液，以2 BV/h 流速通過(guò)樹(shù)脂并浸泡3 h，用蒸餾水洗至中性。

1.2.4 大孔吸附樹(shù)脂的篩選

1.2.4.1 大孔樹(shù)脂對(duì)榅桲總多酚吸附率的測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取預(yù)處理過(guò)的大孔樹(shù)脂各2.0 g，置于磨口錐形瓶中，分別加入樣品液30 mL，密封，搖勻，在室溫放置24 h，時(shí)時(shí)振搖至吸附平衡。分別精密量取各樹(shù)脂吸附后的溶液0.4 mL 于25 mL 容量瓶中，顯色后于757 nm 處測(cè)定吸光度，計(jì)算各濾液中總多酚的濃度，按下面的公式計(jì)算總多酚吸附量和吸附率。

吸附量(mg/g 樹(shù)脂)=［(C0-C1)×V1］/W

吸附率(%)=［(C0-C1)/C0］×100

式中:C0為初始樣品液質(zhì)量濃度(mg/mL);C1為吸附后上清液中樣品液質(zhì)量濃度(mg/mL);V1為加入樣品液體積(mL);W 大孔吸附樹(shù)脂質(zhì)量(g)。

1.2.4.2 大孔樹(shù)脂對(duì)榅桲總多酚解吸率的測(cè)定

將上述吸附飽和的11 種大孔樹(shù)脂過(guò)濾后，加入60%的乙醇溶液30 mL，密封后搖勻，在室溫放置24 h，時(shí)時(shí)振搖，使榅桲總多酚解吸附，過(guò)濾，精密量取各樹(shù)脂解吸附后的溶液0.4 mL，于25 mL 容量瓶中，顯色，測(cè)定吸光度，計(jì)算各種樹(shù)脂對(duì)榅桲總多酚的解吸率。

解吸率t(%)=［(C2×V)/(W×CA)］×100

式中:CA 為吸附量(mg/g 樹(shù)脂);C2為解吸液中多酚液質(zhì)量濃度(mg/mL);V 為所加乙醇的體積(mL);W 為大孔吸附樹(shù)脂質(zhì)量(g)。

1.2.5 大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附-解吸條件的優(yōu)化

由篩選實(shí)驗(yàn)選出一種理想大孔吸附樹(shù)脂，按

1.2.3 方法先進(jìn)行預(yù)處理，濕法裝入1.5×25.0 cm層析柱中，分別考察上樣液質(zhì)量濃度、上樣量、上樣流速和洗脫液濃度、洗脫液用量、洗脫流速等進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附及解吸實(shí)驗(yàn)，確定最佳工藝條件。

1.2.6 PTP1B 抑制作用的研究

將用大孔吸附樹(shù)脂純化前后的榅桲多酚按照文獻(xiàn)［15］方法，即樣品用適量DMSO 溶解，取1 μL 加入至200 μL 反應(yīng)體系中(pH 6.0，1 mmol/L EDTA，0.1 mol/L NaCl，5 mmol/L DDT，50 mmol/L 檸檬酸)，加入底物pNPP 至10 mmol/L，加人人重組PTP1B(PROSPEC)0.5 μg 開(kāi)始反應(yīng)，37 ℃保溫30 min，加入10 mmol/L NaOH 20 μL 終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在405 nm 測(cè)定吸收度(A)值，以原釩酸鈉作為陽(yáng)性對(duì)照，以不加PTP1B 為空白對(duì)照，計(jì)算抑制率:

抑制率=(OD405空白-OD405樣品)/OD405空白×100%

應(yīng)用Origin 軟件計(jì)算IC50值，以此判斷榅桲總多酚對(duì)PTP1B 的抑制能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹(shù)脂的篩選

如表1 所示，11 種大孔吸附樹(shù)脂對(duì)榅桲多酚的吸附率和解吸率均有不同。其中對(duì)榅桲多酚的吸附量較大的三種樹(shù)脂依次為HPD-300、HPD-100、AB-8型樹(shù)脂。這可能是大孔樹(shù)脂的吸附原理主要為物理吸附，比表面積越大，表面張力隨之增大，吸附量就會(huì)提高。這三種樹(shù)脂的解吸率看，前兩種樹(shù)脂的解吸率低，AB-8 型大孔樹(shù)脂的解吸率在11 種樹(shù)脂中最高(79.68%)。AB-8 型大孔樹(shù)脂比表面積中等，且具有較大的孔徑，吸附-解吸綜合性能比較合理，因此選擇AB-8 型大孔吸附樹(shù)脂來(lái)分離純化榅桲總多酚。

表1 11 種大孔樹(shù)脂的性質(zhì)和靜態(tài)吸附與解吸數(shù)據(jù)Table 1 Physical properties and static adsorption-desorption rate of 11 macroporous resins

2.2 大孔吸附樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附條件的優(yōu)化

2.2.1 上樣液濃度的選擇

將榅桲多酚樣品液稀釋成0.02、0.04、0.06、0.08、0.16 g/mL 等不同濃度的上樣液，以2 BV/h的流速上樣，測(cè)定流出液中榅桲總多酚的濃度，計(jì)算吸附量。結(jié)果如圖1 所示，當(dāng)樣液濃度小于0.04 g/mL 時(shí)，隨著樣液濃度的增加，吸附量增大，但高于0.04 g/mL 后多酚吸附率又有所降低。所以，并不是濃度越大吸附效果越好，藥液的澄清度也會(huì)影響樹(shù)脂的吸附效果，上樣液濃度過(guò)大時(shí)，榅桲多酚在樹(shù)脂內(nèi)部擴(kuò)散速度減慢，賭賽樹(shù)脂空隙而影響吸附。因此，選擇上樣液質(zhì)量濃度為0.04 g/mL。

圖1 上樣液濃度對(duì)吸附量的影響Fig.1 Effect of sample concentration on adsorption capacity

2.2.2 上樣液流速的選擇

取0.04 g/mL 榅桲提取液9 BV，分別以1、2、3、4 BV/h 的流速進(jìn)行吸附，測(cè)定流出液中榅桲多酚的濃度，計(jì)算出吸附量。由圖2 可知，隨著上樣流速的增加，吸附量整體呈下降趨勢(shì)。上樣液流速越慢，被吸附物質(zhì)能充分?jǐn)U散到樹(shù)脂的內(nèi)表面，從而吸附的越完全［16］。為了節(jié)省時(shí)間，選擇上樣液流速以2 BV/h 較為適宜。

圖2 上樣流速對(duì)吸附量的影響Fig.2 Effect of sample flow rate on adsorption capacity

2.2.3 上樣量的選擇

取榅桲粗提取液以2 BV/h 的流速上柱后，分步收集漏出液，每20 mL(1 BV)收集1 個(gè)流份，測(cè)定漏出液中榅桲多酚的濃度。結(jié)果如圖3 所示，隨著上樣量的增加，流出液中榅桲多酚質(zhì)量濃度不斷上升，上樣量從9 BV 開(kāi)始，泄露速度趨于比較穩(wěn)定，即9～14 BV 達(dá)到一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡。上樣量達(dá)到15 BV時(shí)，流出液與上樣液總酚含量幾乎相等。但上樣量過(guò)多，不僅會(huì)使純化周期將延長(zhǎng)，工作效率降低，而且會(huì)影響多酚總收率。綜合考慮，選擇上樣量為11 BV。

圖3 AB-8 大孔樹(shù)脂對(duì)榅桲多酚的動(dòng)態(tài)吸附曲線(xiàn)Fig.3 Adsorption curve of C.oblonga polyphenols on AB-8 resin

2.3 大孔吸附樹(shù)脂動(dòng)態(tài)解吸條件的優(yōu)化

2.3.1 除雜用水量的選擇

將已吸附榅桲多酚提取液飽和的AB-8 樹(shù)脂柱，用水以1、2、3、4、5 BV/h 流速洗脫，測(cè)定流出液中總多酚含量。由圖4 可知，開(kāi)始時(shí)有少量未被吸附的多酚沖洗下來(lái)，當(dāng)用水量到3 BV 時(shí)，流出液接近無(wú)色，水洗脫體積3 BV 后開(kāi)始有微量多酚被洗脫，因此選擇水洗脫體積為3 BV。能快速淋洗樹(shù)脂柱以除去蛋白質(zhì)、多糖等水溶性雜質(zhì)。

圖4 除雜用水量的選擇Fig.4 Selection of the volume of elution water

2.3.2 洗脫劑濃度的選擇

取0.04 g/mL 榅桲提取液11 BV 上AB-8 大孔樹(shù)脂柱后，首先用蒸餾水3 BV 洗去雜質(zhì)，然后依次用30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%乙醇水溶液各3 BV 洗脫，每1 BV 收集1 個(gè)流份，測(cè)定榅桲多酚的質(zhì)量濃度，計(jì)算解吸率。由圖5 可知，榅桲多酚的解吸率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)不同有差別，乙醇濃度50%和60%時(shí)解吸率分別為80%和79%。因此，以50%乙醇溶液作為最佳洗脫劑。

圖5 不同乙醇濃度洗脫榅桲多酚曲線(xiàn)Fig.5 Elution curve of C.oblonga polyphenols with different concentrations of ethanol

2.3.3 洗脫液流速的選擇

取0.04 g/mL 榅桲提取溶液11 BV，以2 BV/h流量上樣吸附，依次用3 BV 體積蒸餾水洗脫，分別用50%的乙醇溶液以1、2、3 BV/h 的速度洗脫，收集洗脫液，分別測(cè)定洗脫液中榅桲多酚的濃度。如圖6 所示，當(dāng)洗脫流速小于2 BV/h 時(shí)，榅桲多酚質(zhì)量濃度隨著流速的增大而增大;洗脫流速大于2 BV/h 時(shí)，質(zhì)量濃度隨著洗脫流速的增大而減小。這是由于洗脫流速太慢時(shí)，解吸時(shí)間長(zhǎng)、解吸的雜質(zhì)多;2 BV/h 時(shí)洗脫液中榅桲多酚達(dá)到最大質(zhì)量濃度，因此選擇2 BV/h 為最佳洗脫液流速。

圖6 洗脫液流速的選擇Fig.6 Selection of elution rate

2.3.4 洗脫液體積的選擇

按上述2.2 中選擇的上樣條件進(jìn)行層析，吸附之后，用3 BV 蒸餾水快速洗去水溶性雜質(zhì)。用50%乙醇溶液，流速為2 BV/h 進(jìn)行洗脫，每1 BV 收集1 個(gè)流份，分別測(cè)定各流份中榅桲多酚的質(zhì)量濃度。如圖7 所示，洗脫液用量在2 BV 以?xún)?nèi)時(shí)，洗脫液中多酚濃度隨洗脫液用量增大而升高，用量大于2 BV 后，50%乙醇洗脫液中多酚量隨洗脫體積的增大逐漸減少，到5 BV 時(shí)，洗脫液中幾乎已無(wú)多酚，考慮到生產(chǎn)成本，選擇洗脫液體積為4 BV。

圖7 洗脫體積的選擇Fig.7 Selection of elution volume

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

按上述所確定的純化榅桲多酚的吸附和洗脫條件，重復(fù)試驗(yàn)3 次，收集洗脫液，濃縮干燥的純化物浸膏總多酚質(zhì)量濃度為30.11 mg/g，是粗提物(9.55 mg/g)的3 倍。

表2 榅桲總多酚的PTP1B 抑制活性Table 2 The inhibition activity of total polyphenols from C.oblonga on PTP1B

2.5 榅桲多酚對(duì)蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)抑制作用的研究

將得到的榅桲總多酚提取物進(jìn)行PTP1B 抑制作用的研究。如表2 所示，榅桲總多酚對(duì)PTP1B 有較強(qiáng)的抑制作用，用大孔樹(shù)脂純化后活性明顯提高。陽(yáng)性對(duì)照原礬酸鈉的IC50為1.81 μg/mL。

3 結(jié)論

通過(guò)考察11 種大孔吸附樹(shù)脂，確定AB-8 型大孔樹(shù)脂對(duì)榅桲多酚有較好的吸附和解吸性能，適用于榅桲總多酚的純化。最佳純化條件為:上樣濃度為0.04 g/mL，上樣量為11 BV，上樣流速為2 BV/h，用3 BV 蒸餾水除雜后，以50%乙醇溶液為洗脫劑，洗脫液用量為4 BV，流速為2 BV/h 進(jìn)行洗脫。在此條件下，經(jīng)AB-8 樹(shù)脂純化后，榅桲總多酚質(zhì)量濃度達(dá)到了30.11 mg/g，是粗提物的3 倍。而且榅桲總多酚對(duì)PTP1B 有較強(qiáng)的抑制作用，其IC50為16.14 μg/mL。實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)樹(shù)脂純化，去除了大量的雜質(zhì)，提高了總多酚的含量和PTP1B 抑制作用，對(duì)榅桲總多酚有較好的精制效果。

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3 Editorial Committee of Chinese Medical Encyclopedia(中國(guó)醫(yī)學(xué)百科全書(shū)編輯委員會(huì)).Encyclopedia of Chinese Medicine-Uighur medicine(中國(guó)醫(yī)學(xué)百科全書(shū)維吾爾醫(yī)學(xué)).Shanghai:Shanghai Science and Technology Press，2005.177.

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