蚯蚓葡萄糖氧化酶的提取純化研究

李 嬌，原 琳，榮永海，榮 龍

北京航空航天大學生物與醫學工程學院，北京 100191

蚯蚓，又稱地龍，屬寡毛綱環節動物門。在我國入藥已有四千余年的歷史，具有解熱、鎮痙、活絡、平喘等功效，是一種常見的動物藥材［1］。近年來，研究者發現蚯蚓含有多種生物活性成分，并且具有多方面的藥理作用和臨床療效，引起了人們的廣泛關注［2］。目前，研究主要集中在蚯蚓纖溶酶、抗腫瘤蛋白［3］、抗菌肽［4］等成分的提取和純化方面。研究表明，蚯蚓體內還含有豐富的抗氧化酶，它們具有重要的生理功能，可以清除體內多余的自由基，能夠治療疾病，延緩衰老。

蚯蚓體內的抗氧化酶類包括過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽還原酶(GSH-R)、葡萄糖氧化酶(GOD)等，其中，我室對蚯蚓中SOD 和CAT 提取的相關研究已經比較成熟［5］。有氧條件下能專一性地催化β-D-葡糖生成葡萄糖酸和過氧化氫［6］，在各行業具有廣泛的應用。在食品工業中，GOD 可用于去葡萄糖［7］、脫氧［8］、殺菌、測定葡萄糖含量等;在醫藥行業，GOD 可以用于尿糖試紙，血糖試紙和葡萄糖酸的生產等;在生物方面，GOD 是生物傳感器領域最主要的工具酶［9］。目前，GOD 的提取來源主要有黑曲霉和青霉屬菌株［8］，動植物組織中GOD 的含量極其低，未見從蚯蚓中提取純化GOD的相關報道。如果從蚯蚓中提取并純化得到GOD，這不僅將拓寬GOD 的來源，并且能夠擴展蚯蚓的應用范圍，對蚯蚓的進一步開發利用具有重要意義。

在此前的研究中，本實驗室采用閃式提取法對鐵皮石斛多糖［10］、羅漢果多酚［11］、柑橘檸檬苦素［12］、羅漢果甜苷［13］等生物成分進行提取，與傳統提取方法相比，在提取時間，提取效率方面具有明顯的優勢，因此，從節能高效方面考慮，本研究采取閃式提取這一新型方法對GOD 進行提取。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

實驗用赤子愛勝蚯蚓(Eisenia fetida)由天津蚓福生物科技開發有限公司提供;羧甲基纖維素CM-22 購買自英國Whatman 公司;二乙胺基乙基纖維素(DEAE-Cellulose)購自上海試劑二廠;GOD 活性檢測用苯酚和葡萄糖購自北京化工廠，4-氨基安替比林和Triton X-100 均購自國藥集團化學試劑有限公司;蛋白檢測用考馬斯亮藍G-250 購自美國Amresco公司;其他試劑均從北京化工廠購買;全部試劑均為分析純或色譜純等級;實驗過程中所使用雙蒸水由實驗室自己制得。

1.2 主要儀器與設備

ArantiTMJ-25 型低溫高速離心機，美國Beckman Coulter 公司;SP-756P 型分光光度計，上海光譜儀器有限公司;JHBE-50S 型閃式提取器，北京金鼐科技發展有限公司;蛋白分離純化層析柱，上海錦華層析設備廠;868 型酸度計，美國Orion 公司;雙蒸水過濾器，美國PALL 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蚯蚓的預處理

取100 g 冷凍新鮮蚯蚓(已洗凈)，剪碎，以1∶4(m/v)的體積加入已預冷的50 mmol/L pH 4.8 的醋酸緩沖液(1 mmol/L EDTA)，使用閃式提取器進行提取(轉速5500 rpm，提取兩次，每次30 s，每次間隔5 min)，閃提后使用800 W 超聲提取器提取30 min，凍存(-70 ℃)12 h。凍存液溶化后使用低溫離心機離心(轉速10000 rpm，時間50 min)，離心得到的上清液為粗酶液，測定酶活及蛋白濃度。

1.3.2 預處理條件的正交優化

1.3.2.1 單因素實驗

對于蚯蚓的預處理步驟，影響酶活的主要因素有緩沖液的pH 值、固液比、閃提時間、閃提轉速及超聲時間。為優選正交試驗的條件及水平，先對各因素進行單因素實驗。單因素實驗的因素及水平見表1。

表1 單因素實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of single factor experimental design

1.3.2.2 正交試驗

根據單因素實驗的結果，選取對酶活影響較大的因素作為正交試驗的考察因素，正交試驗的因素水平表見表2。

表2 正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal test

1.3.3 GOD 的純化

1.3.3.1 酸沉淀

用醋酸將粗提液的pH 調至4.5，冰箱中(-20℃)放置15 min，離心(轉速10000 rpm，4 ℃，50 min)，離心后取上清，測酶活，測蛋白濃度。

1.3.3.2 CM-22

CM-22 離子交換柱填料按說明處理，裝柱后用50 mmol/L pH 4.5 的醋酸緩沖液平衡。酸沉淀后的上清液pH 調至4.5，上CM-22 柱(2.5 cm×45 cm)，流速2 mL/min，用同緩沖液洗凈。CM-22 吸附柱用0.6 mol/L pH 5.0 醋酸緩沖液進行洗脫，流速1 mL/min，收集液即為GOD 粗提液，測定酶活，蛋白濃度。收集液用2.5 mmol/L pH 7.6 的磷酸緩沖液透析4 h。

1.3.3.3 DEAE-Cellulose

DEAE-Cellulose 離子交換柱填料按說明處理，裝柱后用2.5 mmol/L pH 7.6 的磷酸緩沖液平衡。透析后的酶粗提液上DEAE-C 柱(1.6 cm×30 cm)，用同緩沖液洗凈，然后用0.6 mol/L 的NaCl 溶液進行洗脫，流速1 mL/min，收集液即為GOD 酶液，測定酶活，測定蛋白含量。

1.3.4 GOD 活性測定

［14，15］的方法，反應體系為3 mL，其中包含pH 7.0 0.1 mol/L 的磷酸緩沖液，16 mmol/L的苯酚及4 mmol/L 的Triton X-100，7.5 mmol/L 的4-氨基安替吡啉，0.55 mol/L 的葡萄糖溶液以及0.1 mg/mL 的辣根過氧化物酶，上述混合溶液震蕩混勻后，加入0.1 mL 葡萄糖氧化酶溶液，SP-756P 型分光光度計，于37 ℃、λ=500nm 自動記錄隨時間變化的吸光度值。酶活力單位定義為:在上述條件下，每毫升溶液中每分鐘催化葡萄糖水解產生1 μmol 產物的酶量。比活力定義為:每毫克酶蛋白所具有的酶活力單位數。

1.3.5 蛋白濃度的測定

蛋白質濃度采用考馬斯亮藍法測定，參考文獻［16］，以標準牛血清蛋白為標準品繪制曲線。

1.3.6 熱穩定性

在含0.1 mol/L pH7.0 的磷酸緩沖液中，將GOD 酶液分別置于-18、4、10、20、30、40、50、60、70、80 ℃水浴中，保溫2 h，分別測定酶活性。

1.3.7 pH 值穩定性

將GOD 酶液置于0.1 mol/L 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH 2～8)、0.1 mol/L 的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH 9～10)、0.1 mol/L 的磷酸氫二鈉-氫氧化鈉緩沖液(pH 11)中，4 ℃保溫2 h 后，分別測定酶活性。

1.3.8 最適溫度

將酶反應體系在22～77 ℃下孵育30 min，分別測定GOD 的活性。

1.3.9 最適pH

將GOD 酶液置于用0.1 mol/L 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH 2～8)、0.1 mol/L 的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH 9～10)、0.1 mol/L 的磷酸氫二鈉-氫氧化鈉緩沖液(pH 11)配制成的反應體系中反應，計算反應后酶活。

2 實驗結果

2.1 蚯蚓預處理的優化

2.1.1 單因素實驗結果及分析

2.1.1.1 pH 值如圖1 所示，當緩沖液的pH 值由3.8 升到4.8時，GOD 的比活上升，隨后下降，但是變化趨勢不明顯，因此，正交試驗時不考慮此因素。當pH 為4.8時，GOD 的比活最高，因此，閃提時緩沖液的pH 選為4.8。

圖1 pH 值對比活的影響Fig.1 Effect of pH value on the specific activity of GOD

2.1.1.2 固液比

圖2 表明，GOD 的比活先隨液固比升高而升高，當液固比為4∶1(mL/g)時，酶的比活達到最高，隨后下降，且趨勢明顯，因此，該因素被選為正交試驗的考察因素。

圖2 固液比對比活的影響Fig.2 Effect of solid/liquid ratio on the specific activity of GOD

2.1.1.3 閃提時間

圖3 表明，隨著閃提時間的增加，GOD 的比活有升高的趨勢，當閃提時間達到45 s 后，比活開始下降，趨勢明顯，因此閃提時間可選為正交試驗的考察因素。

圖3 閃提時間對比活的影響Fig.3 Effect of flash extraction time on the specific activity of GOD

2.1.1.4 閃提轉速

如圖4 所示，隨著閃提轉速的增加，GOD 的比活略有升高，當轉速達到2800 rpm 后，比活開始下降，當轉速由2200 rpm 升高到3500 rpm 的過程中，GOD 的比活變化很小，因此排除此因素，在實驗過程中，選取2800 rpm 為實驗轉速。

2.1.1.5 超聲時間

圖5 表明，隨著超聲時間的增長，GOD 的比活升高，當超聲時間達到30 min 后，比活開始下降，且整個過程變化趨勢明顯，因此該因素可選為正交試驗的考察因素。

圖4 閃提轉速對比活的影響Fig.4 Effect of flash extraction speed on the specific activity of GOD

圖5 超聲時間對比活的影響Fig.5 Effect of Ultrasonic extraction time on the specific activity of GOD

2.1.2 正交試驗的結果及分析

如表3 所示，影響蚯蚓GOD 比活的因素主次影響順序為A＞B＞C，即固液比＞超聲時間＞閃提時間。三個因素的最佳搭配組合為A3B2C2，即固液比1∶4.5(g/mL)，超聲時間30 min，閃提時間45 s，在此條件下，蚯蚓預處理部分效果最好。

表3 正交試驗結果Table 3 Results of L9(34)experimental design for the extraction of GOD

正交試驗的方差分析結果如表4 所示。料液比對蚯蚓GOD 的酶活影響比較顯著，而超聲時間和閃提時間兩因素對GOD 酶活的影響相對不顯著，影響主次順序為料液比＞閃提時間＞超聲時間，這與極差分析的結果有一定不同，不過從數據可以看出，閃提時間與超聲時間對GOD 提取的影響顯著性差距不大，因此會出現分析結果的差異，以方差分析結果為準，即料液比＞閃提時間＞超聲時間。

表4 方差分析Table 4 ANOVA of the GOD extraction

2.2 蚯蚓GOD 的純化

GOD 粗酶液經酸沉淀后，比活為131.87 mU/mg。CM-22 的洗脫收集液液，比活為368.13 mU/mg。DEAE 柱的洗脫收集液，比活為2684.21 mU/mg，純化倍數達到了37 倍，如表5 所示。

表5 蚯蚓GOD 純化結果Table 5 Purification results of GOD from the earthworm

GOD 的提取純化現狀如表6 所示，GOD 主要來源于青霉與黑曲霉［15，17］，提取純化工藝比較成熟，純化方法包括超濾濃縮、硫酸銨鹽析、DEAE-纖維素離子交換層析、Sephadex 凝膠過濾純化等，倍數大約為20～30，回收率約為30%，本實驗中GOD 的純化倍數達到了37 倍，回收率達到了61%，與已知的青霉菌與黑曲霉的純化工藝相比，純化步驟簡單，回收率高，純化倍數高，達到了很好的提取效果。

表6 GOD 的提取純化現狀Table 6 Extraction and purification status of GOD

2.3 蚯蚓GOD 的穩定性

2.3.1 GOD 的溫度穩定性

如圖6 所示，蚯蚓GOD 在20 ℃時穩定性最好，在4～30 ℃之間具有較好的穩定性，當溫度達到60℃時，GOD 幾乎喪失全部活性。

2.3.2 GOD 的pH 值穩定性

結果如圖7 所示，蚯蚓GOD 在pH4～7 之間具有良好的穩定性(相對活性在80%以上)，與昆蟲來源的GOD 近似［17］。當pH 8 時，相對酶活也在60%以上，當pH 為2 及pH 大于9 時，GOD 幾乎完全失活。根據GOD 對不同pH 值的敏感性，在實驗過程中，緩沖體系的pH 一直保持在pH4～7 之間。

圖6 蚯蚓GOD 的熱穩定性Fig.6 Temperature stability of GOD

圖7 蚯蚓GOD 的pH 值穩定性Fig.7 pH stability of GOD

圖8 蚯蚓GOD 的最適反應溫度Fig.8 The optimal reaction temperature of GOD

2.4 蚯蚓GOD 的最適反應溫度

如圖8 所示，GOD 的最適反應溫度為37 ℃，這與青霉菌來源的GOD［17］基本是一致的，當溫度低于32 ℃或者高于57 ℃時，相對酶活性下降至40%以下。所以，我們在實驗中檢測GOD 酶活性時溫度控制在37 ℃。

2.5 蚯蚓GOD 的最適pH 值

如圖9 所示，GOD 的反應活性對pH 值非常敏感，它的最適反應pH 值為7，當pH 值大于7 時，酶活迅速降低，當pH 值小于6 時，相對酶活降低到60%以下。所以，在檢測GOD 活性時，反應體系的pH 一定要嚴格控制為7。

3 結論

圖9 蚯蚓GOD 的最適pH 值Fig.9 The optimal reaction pH value of GOD

在本研究中，我們利用閃式提取技術提取蚯蚓葡萄糖氧化酶(GOD)，并采用正交試驗法優化了閃提及超聲實驗條件，得到的最優條件為:固液比1∶4.5(g/mL)，閃提時間45 s，超聲時間30 min。

利用柱層析等方法對蚯蚓GOD 進行純化，最終回收率達到了60.8%，純化倍數達到了37.2。本實驗提純的GOD 最適pH 為7，酶在pH4～7 區間較穩定，酶活保持在80%以上，酶最適溫度為37 ℃，溫度升高時，酶迅速失活，此結果表明蚯蚓來源的GOD 與真菌來源GOD 在穩定性方面具有一定差異性，這對進一步的研究及工業應用具有一定的指導意義。本研究成功從蚯蚓中純化得到GOD，不僅拓寬了GOD 的生物來源，同時提高了蚯蚓的綜合利用率。

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