絲素肽的制備及其抗氧化活性研究

谷平平，李琳琳，婁小平*，金 歌

1 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，鄭州 450000;2 許昌陶瓷職業(yè)學(xué)院，禹州 461670

絲素蛋白由于其結(jié)構(gòu)致密，溶解性差，導(dǎo)致其雖然具有良好的營養(yǎng)價值，但難以被人體所吸收，利用程度較低，故通常需將絲素蛋白進(jìn)行水解，降解成具有獨特的生理活性和藥用價值的多肽類物質(zhì)。根據(jù)新天絲生物技術(shù)有限公司的報道，經(jīng)硫酸化處理過的絲素蛋白水解產(chǎn)物可以被制成抗凝藥劑，經(jīng)抗血液凝固活性試驗，發(fā)現(xiàn)它像肝素一樣，具有抗血液凝固活性，可替代肝素廣泛的應(yīng)用于如尿毒癥病人人工透析或體外循環(huán)時血液中的抗凝劑。Rhee SK 等曾將絲素蛋白水解后的產(chǎn)物分別配成0.3%、0.6%、0.9%的濃度，加入到泡菜中，結(jié)果表明，對乳酸菌的生長有顯著抑制作用，證明絲素肽具有抗菌作用。絲素肽具有良好的吸收機(jī)制，并具有一些不可比擬的生理功能，如降血糖作用、降膽固醇作用、抗氧化作用、改善腸道生理功能、防止腦老化和冷凍保護(hù)作用等，因此絲素在功能性食品、化妝品及醫(yī)藥等多個領(lǐng)域具有很高的開發(fā)價值。本文對絲素肽的抗氧化活性進(jìn)行了探索研究，為將絲素肽開發(fā)為功能性食品或食品添加劑奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料與主要試劑

廢蠶絲:農(nóng)戶處購買;堿性蛋白酶(Alcalase 2.4 L)3.11×107 U/g，丹麥諾維信酶制劑公司，食品級。NaOH，鄰苯三酚，乙醇，水楊酸，均為分析純，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 主要儀器

半自動凱氏定氮儀，HR-500，上海華睿儀器有限公司。

2 實驗方法

2.1 水解度(DH)的測定

采用pH-stat 法［1］測定絲素蛋白的水解度，計算公式如下所示。

式中:B:消耗的NaOH 量(mL);Nb:NaOH 摩爾濃度;ɑ=10pH-pK/(1+10pH-pK)，其中pK 為氨基酸的平均pK，按7.0 算(平均解離常數(shù));pH 為反應(yīng)起始pH 值;α:α-氨基酸的平均解離度;htot:每克絲素蛋白中肽鍵的mmol 數(shù)(mmol/g)，對于絲素蛋白h=12.4 mmol/g;m:蛋白質(zhì)總量。

2.2 堿性蛋白酶降解絲素蛋白的單因素實驗

堿性蛋白酶Alcalase2.4 L 所能作用的肽鍵的范圍較寬，并對結(jié)晶區(qū)中由丙氨酸、甘氨酸或酪氨酸參與形成的肽鍵有特異性，所以能使絲素更大程度地水解［2-5］，因此，本試驗選用堿性蛋白酶作為水解用酶。

在酶解反應(yīng)中，為了使酶解反應(yīng)能充分進(jìn)行，需要篩選合適的酶解條件，從而使酶顯示出足夠的催化活性。影響酶解效果的因素主要有底物濃度、加酶量、pH 值、溫度和時間。因此，本實驗對這五個因素進(jìn)行了單因素實驗，即在加酶量為2%、pH 為8.5，反應(yīng)溫度為55 ℃，反應(yīng)時間為4 h 的條件下，分別設(shè)定底物濃度為2%、3%、4%、5%、6%、7%對絲素蛋白進(jìn)行酶解，并測定其水解度;在底物濃度為5%，pH 為8.5，溫度為55 ℃，反應(yīng)時間為4 h 的條件下，分別以加酶量1.0%、1.5%、2%、2.5%、3.0%、3.5%對絲素蛋白進(jìn)行酶解，并測定其水解度;在加酶量為2.0%、底物濃度為5%，溫度為60℃，反應(yīng)時間為4 h 時，參考堿性蛋白酶的最適作用條件，分別在pH 為7.5、8.0、8.5、9.0、9.5 對絲素蛋白進(jìn)行酶解，并測定其水解度;酶促反應(yīng)受溫度影響較大，酶解溫度太低，蛋白酶不易激活，反應(yīng)速度較慢，溫度過高則會引起酶蛋白變性失活，因此，在加酶量為2.0%、底物濃度為5%，pH 為8.5，反應(yīng)時間為4 h 時，分別以溫度為45、50、55、60、65 ℃對絲素蛋白進(jìn)行酶解反應(yīng)，并測定其水解度;在加酶量為2%、底物濃度為5%，pH 為8.5，溫度為55 ℃時，分別在1.0、2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5、5.5 h 時測定其水解度。

2.3 堿性蛋白酶降解絲素蛋白的正交實驗

通過堿性蛋白酶水解絲素蛋白的單因素實驗，選定合適的正交試驗的因素水平，進(jìn)一步優(yōu)化酶解條件，得出絲素蛋白的最佳酶解工藝條件，正交實驗因素水平表如表1 所示。

表1 L9(34)正交實驗因素水平表Table 1 Levels and factors of the L9(33)orthogonal test

將一定濃度的底物與酶在恒溫?fù)u床中進(jìn)行反應(yīng)，不斷加入0.5 mol/L NaOH，從而使反應(yīng)體系的pH 值保持在試驗規(guī)定的范圍內(nèi)，用pH-stat 法測定水解度。水解反應(yīng)終止時煮沸10 min 進(jìn)行滅酶［6-9］。冷卻后，酶解液以10000 rpm 的速度離心20 min，除去蛋白酶及未水解完全的絲素蛋白，取上清液濃縮得到絲素肽產(chǎn)物。

2.4 抗氧化活性的測定

式中:A0為空白對照液的吸光值;Ax 為加入水解液后的吸光值。

2.4.2 絲素肽清除羥基自由基(·OH)能力的測定

Fe2+與H2O2混合產(chǎn)生·OH，加入水楊酸可捕捉·OH，并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510 nm 下有特征吸收。根據(jù)此原理，在反應(yīng)體系中依次加入0.2 mol/L 的磷酸緩沖液(pH 為7.4)6 mL，10 mmol/L的水楊酸1 mL，3.8 mmol/mL FeSO4-EDTA(1∶1)1 mL，然后加入10 g/L 的水解產(chǎn)物2 mL，最后加入2 mL 8 mmol/L H2O2啟動反應(yīng)。以2 mL 去離子水代替水解產(chǎn)物作為對照組，37 ℃條件下水浴恒溫60 min，之后加入2 mL 6 mol/L HCl 終止反應(yīng)［12］，在510 nm 測定吸光值。經(jīng)測定得出不同水解度下的產(chǎn)物對·OH 的清除率。

式中:A0為空白對照液的吸光值;Ax 為加入水解液后的吸光值。

2.4.3 絲素肽清除二苯代苦味酰基(DPPH·)能力的測定

二苯代苦味酰基(DPPH·)法是一種廣泛應(yīng)用于篩選抗氧化劑的方法，其主要是因為DPPH 在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，其孤對電子在517 nm 附近有強(qiáng)吸收(乙醇溶液呈紫色)。當(dāng)有自由基清除劑存在時，孤對電子被配對，吸收消失或減弱，通過測定吸收減弱的程度可評價自由基清除劑的活性。

用無水乙醇配制1 mmol/L 的DPPH 溶液，冰箱避光保存，將2 mL 蒸餾水與2 mL 1 mmol/L 的DPPH·乙醇溶液加入同一試管中，搖勻，放置30 min，于517 nm 處測定其吸光A0，即為空白對照液的吸光值，測定樣品清除能力時，2 mL 濃度為10 g/L 的絲素肽樣品與2 mL 1 mmol/L 的DPPH·乙醇溶液混勻于試管中，靜置30 min 后，5000 rpm 離心5 min［13］，取上清液測定其吸光度Ax，即為絲素肽樣液的吸光值，同時測定絲素蛋白水解溶液與2 mL 無水乙醇混合后的吸光度Ax。經(jīng)測定得出不同水解度下的產(chǎn)物對DPPH·的清除率，清除率越高表明抗氧化越強(qiáng)。

式中:A0為空白對照液的吸光值;Ax為加入水解液后的吸光值。

3 結(jié)果與分析

3.1 堿性蛋白酶的單因素實驗結(jié)果分析

堿性蛋白酶Alcalase 是NOVO 酶制劑公司產(chǎn)品，在我國被廣泛應(yīng)用于絲綢、皮革、食品和醫(yī)藥工業(yè)以及生物技術(shù)領(lǐng)域，具有很高的水解蛋白質(zhì)能力［14-16］。

由圖1 是各因素對絲素蛋白水解度的影響曲線，由圖1 可知當(dāng)?shù)孜餄舛仍?%～5%之間時，隨著底物濃度的增加，水解度不斷提高;超過5%時水解度開始下降。因此本實驗選用的底物濃度的水平范圍為3%、4%、5%。隨著加酶量的增加，水解度逐漸提高，即酶解效果越好;但是，當(dāng)加酶量超過2.5%時，堿性蛋白酶催化水解絲素蛋白的水解度變化幅度較小，基本達(dá)到平衡狀態(tài)，即水解度的提高并不與加酶量同倍增加，故選用的加酶量的水平范圍為1.5%、2.0%、2.5%。隨著pH 由7.5 增大至8.5，曲線變化幅度較大，堿性蛋白酶催化絲素蛋白的水解度明顯增大，在pH 為8.5 時其水解度最大;當(dāng)pH 超過8.5 后，曲線呈下降趨勢，但pH 為9 時的水解度依舊高于pH 為7.5 和8 的。故本實驗選用的pH 值水平為8、8.5、9。該反應(yīng)的水解度隨著溫度上升而增加，當(dāng)溫度為60 ℃時，反應(yīng)DH 達(dá)到最大值22%，繼續(xù)提高反應(yīng)溫度反而會降低反應(yīng)的DH 值，這可能是Alcalase 酶在高溫下變性，從而導(dǎo)致酶催化活性減弱，不利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行所致。在水解1～4 h 內(nèi)，曲線的變化幅度較大。繼續(xù)水解時，曲線的變化幅度明顯變小，說明水解程度增加幅度減小。這可能是因為作用4 h 后，堿性蛋白酶Alcalase2.4 L 的底物水解已接近平衡，故本實驗最終選擇3.5、4.0、4.5 h 作為堿性蛋白酶水解絲素蛋白的水平范圍。

3.2 堿性蛋白酶催化絲素蛋白水解反應(yīng)的正交實驗結(jié)果分析

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取的溫度、加酶量、底物濃度、pH、反應(yīng)時間五個因素中，由于溫度對實驗結(jié)果影響較小，故正交試驗以水解度為指標(biāo)，選取底物濃度、pH 值、加酶量、時間四個因素進(jìn)行設(shè)計，每個因素選取三個水平，實驗結(jié)果見表2。

圖1 底物濃度(A)、加酶量(B)、pH(C)、水解溫度(D)及反應(yīng)時間(E)對絲素蛋白水解度的影響Fig.1 Effect of substrate concentration(A)，enzyme dosage(B)，pH(C)，reaction temperature(D)and reaction time(E)on degree of hydrolysis of silk fibroin

表2 L9(34)正交實驗及結(jié)果Table 2 Results of the L9(34)orthogonal test

由上表可知，四個因素對水解度的影響順序依次為:底物濃度＞加酶量＞pH 值＞酶解時間。最優(yōu)方案為A2B3C2D2，即加酶量為2%，酶解時間為4.0 h，底物濃度為5%，pH 值為8.5，反應(yīng)溫度為60 ℃，在此條件下，水解度達(dá)到最大值，可達(dá)23.92%。

3.3 絲素肽的抗氧化活性結(jié)果分析

圖2 是不同水解度條件下的的絲素蛋白水解產(chǎn)物對超氧自由基、·OH 及DPPH·清除能力曲線，由圖2 可知未酶解的絲素蛋白基本沒有清除超氧自由基的能力，但經(jīng)酶解的絲素肽卻表現(xiàn)出不同程度的清除超氧自由基的能力，由此可知酶解絲素蛋白有利于絲素蛋白的抗氧化活性的發(fā)揮。未酶解的絲素蛋白雖然具有一定的清除·OH 的能力，但清除能力較弱。經(jīng)酶解的水解產(chǎn)物表現(xiàn)出不同程度的清除·OH 的能力都明顯高于未水解的絲素蛋白，由此表明酶解絲素蛋白有利于絲素蛋白的抗氧化活性的充分發(fā)揮。未酶解的絲素蛋白基本沒有清除DPPH·的能力，即沒有抗氧化活性。經(jīng)酶降解后的的絲素肽表現(xiàn)出不同程度的清除DPPH·的能力，由此可知絲素蛋白只有被酶降解后才能表現(xiàn)出其抗氧化活性，在堿性蛋白酶Alcalase2.4 L 作用下，絲素肽清除DPPH·的能力隨水解度的提高而不斷增強(qiáng)，但其清除能力與水解度之間并非簡單的線性關(guān)系。

圖2 不同水解度的絲素肽對超氧自由基(A)、·OH(B)、DPPH·(C)的清除能力Fig.2 Scavenging effects of different degrees of silk fibroin peptides on superoxide anion free radical，·OH and DPPH·

4 結(jié)論

通過實驗可以發(fā)現(xiàn)，絲素肽水解液具有一定的抗氧化能力，其中不同水解度的絲素肽的抗氧化能力有所差異。一定范圍內(nèi)，絲素肽的抗氧化能力隨著水解度的增加而增大，但并非是簡單的線性關(guān)系，本實驗中我們可知絲素肽在水解度為23.92%時其抗氧化性達(dá)到最大。

1 Feng YW(馮永巍).The optimization of corn peptide hydrolytics processing and the development of corn peptide functional beverage.Changchun:Jilin Agricultural University(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué))，MSc.2007.

2 Zhang YN(張婭楠)，Zhao L(趙利)，et al.Sudy on hydrolyzed eel head protein by proteases.J Henan Univ Technol(河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報)，2010，31(5):34-36.

3 Chen J(陳晶)，Liu YM(劉友明)，Xiong SB(熊善柏)，et al.Composite protease-enzyme fractional hydrolysis fish protein and flavor process optimization.J Huazhong Agric Univ(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報)，2007，26:704-707.

4 Wu JH(吳金鴻).Study on preparation of sericin peptides and their biological activity function and structure.Wuxi:Jiangnan University(江南大學(xué))，PhD.2008.

5 Li YL(李艷麗)，Chen G(陳光)，et al.Study on alkaline protease hydrolysis to prepare corn peptide.J Jilin Agric Univ(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報)，2004，26:142-144.

6 Lan JJ(藍(lán)建京)，Tan Y(覃玥)，et al.Study on the kinetics of the alkaline protease hydrolysis of silk fibroin.Guangxi Agric Sci(廣西農(nóng)業(yè)科學(xué))，2012，29(3):87-89.

7 Gao G(高光)，Mou GQ(牟光慶).Conditongs of alkali protease hydrolyzing tussah fibroin.Sci Technol Food Ind(食品工業(yè)科技)，2010，31:245-247.

8 Huang L(黃雷)，Wang XY(王學(xué)英)，et al.Study on the optimum condition of enzymatic hydrolysis of silk fibroin.J Anhui Agric Sci(安徽農(nóng)業(yè)科學(xué))，2006，34:428-429.

9 Sui YJ(隋玉杰)，He H(何慧)，Wang J(王進(jìn))，et al.Comparison the anti-alcoholism bioactivities between corn crude peptides prepared by neutrase and alcalase.J Chin Cereals Oils Assoc(中國糧油學(xué)報)，2006，21:102-104.

10 Chen LH(陳力宏).Study on preparation of Cocoon floor peptides and antioxidant activity.Zhenjiang:Jiangsu University(江蘇大學(xué))，MSc.2006.

11 Hou WJ(侯文娟)，Zhang ML(張美莉)，et al.Preparation of antioxidant peptides from Buckwheat Globulin by enzyme hydrolysis.Food Sci(食品科學(xué))，2009，30:274-279.

12 Xu JG(徐建國)，Tian CR(田呈瑞)，et al.Study on scavenging capacity of free radical by natural mulberry red pigment in vitro.Food Sci(食品科學(xué))，2005，26(12):77-80.

13 Wu MM(吳萌萌).Preparation and activity of antioxidant peptides from Spirulina platensis.Beijing:Beijing Forestry University(北京林業(yè)大學(xué))，MSc.2010.

14 Chen J(陳杰).Study on enzymatic hydrolysis of silk fibroin.Suzhou:Soochow University(蘇州大學(xué))，MSc.2001.

15 Li QL(李琦麗)，Wu WG(吳衛(wèi)國)，et al.Stduy on hydrolysis technology of rice residue protein by bi-enzyme hydrolysis.Cereals Oils(糧食與油脂)，2011，21:19-22.

16 Li YL(李艷麗)，Cong JM(叢建民)，Chen G(陳光).Double enzyme hydrolysis for preparation of corn peptides.Food Sci(食品科學(xué))，2010，31:145-148.