西施舌多糖對人食管鱗癌裸鼠移植瘤作用的研究

楊維群，溫揚敏，林文東，謝永華，陳長明

泉州醫學高等專科學校，泉州 362000

多糖(polysaccharide)是由多個單糖分子縮合、失水而成，是一類分子結構復雜且龐大的糖類物質，具有免疫調節、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗衰老等作用［1］。天然產物中存在廣泛的生物活性多糖，從天然產物中分離活性多糖已受到普遍關注。我國具有豐富的海洋資源，海洋生物中的生理活性物質是研究和發展新化學成分，開發新藥的天然寶庫［2］。貝類多糖是存在于貝類體內的一種生物活性物質，結構新穎、功能獨特，有望成為腫瘤治療中新的藥物資源。

西施舌多糖(Polysaccharides from Coelomactra antiquate，PCA)是從海洋經濟貝類西施舌中提取的粗多糖。我們前期體外實驗結果表明西施舌多糖能明顯抑制人食管癌細胞株EC-9706 的生長，在此基礎上，本研究進一步觀察其對人食管鱗癌細胞株EC-9706 裸鼠移植瘤生長情況的影響，期望為西施舌藥用價值開發利用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥物與主要試劑

DMSO，胰蛋白酶液，RPMI1640 培養基，小牛血清均購自賽默飛世爾科技公司(北京)。氯仿(AR，天津市化學試劑一廠)，正丁醇(AR，天津市登科化學試劑有限公司)，生理鹽水(NS，廣東新理想生物制藥有限公司)，環磷酰胺(CTX，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司)。

1.2 西施舌多糖提取

西施舌購自福建福州程普頭市場。選擇殼長7～9 cm 新鮮西施舌成貝，去殼、洗凈、稱取其肌肉50 g，放入500 mL 燒杯，再加入固液比(g/mL)為1∶6的雙蒸水。放置于超聲波清洗機(40 kHz，100 W)，于60 ℃水浴超聲波處理20 min。再用定性濾紙過濾，取濾液Sevag 法除蛋白。加入乙醇使最終乙醇濃度為80%，4 ℃過夜沉淀。6000 g 離心15 min 收集多糖，冷凍干燥得到西施舌多糖粉末［3］。采用苯酚-硫酸法測定總糖含量，吸取10 μg/mL 的樣品液1 mL 測定吸光度，通過標準曲線法求得相應糖濃度值，計算總糖含量為82.17%。

1.3 細胞培養

人食管鱗癌細胞株EC-9706 購自天呈科技生物公司。用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養液，在5% CO2、37 ℃飽和濕度條件下細胞培養箱中培養，2～3 d 換液傳代1 次，實驗用細胞為狀態良好的對數生長期細胞。

1.4 動物實驗

1.4.1 裸鼠皮下移植瘤模型

4～5 周齡SPF 級BALB/c 裸鼠［購自斯萊克實驗動物有限公司，動物合格證號SCXK(滬)2012-0002］，體重15～18 g，SPF 級層流柜飼養3 d 后用于實驗。對數生長期EC-9706 細胞，胰蛋白酶液消化后，用PBS 洗滌，制備1×107/mL 瘤細胞懸液接種于裸鼠右前肢腋部皮下，建立EC-9706 食管鱗癌的異種皮下移植瘤動物模型，7 d 后觀察成瘤率100%，選擇腫瘤直徑0.5 cm 左右的裸鼠進行實驗。

1.4.2 分組與處理

將荷瘤裸鼠按隨機數字表法分為NS(陰性對照)組、CTX(陽性對照)組、西施舌多糖小、中、大3個劑量實驗組，每組10 只，雌雄各半。分別腹腔注射等體積NS、CTX(5 mg/kg)、西施舌多糖(小100、中200、大300 mg/kg)，每天給藥一次，連續給藥26次。各組裸鼠分別從給藥后第2 周起每3 天測量瘤長(L)、瘤寬(S)，根據公式(V):V=0.5×L×S2計算腫瘤體積，繪制移植瘤生長曲線。觀察26 d 后，頸椎脫臼處死裸鼠，稱量瘤、脾、肝濕重，計算抑瘤率和臟器指數［4］。另分別取各組裸鼠的部分新鮮腫瘤組織和肝臟經10%甲醛固定后，常規石蠟切片，HE 染色，光鏡下觀察。

抑瘤率%=［(陰性對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/陰性對照組平均瘤重］×100%

臟器指數=臟器重(mg)/小鼠體重(g)

2 實驗結果

2.1 西施舌多糖對裸鼠體重的影響

西施舌多糖對裸鼠體重影響(見表1)，實驗結束與實驗開始時比較，NS 組裸鼠的體重增加顯著，而CTX 組裸鼠體重無顯著差異。治療期間，西施舌多糖各劑量組的裸鼠一般狀況良好，未見厭食，活躍程度下降等，治療前后體重增加顯著，表明西施舌多糖對裸鼠體重增加無明顯的抑制作用。

表1 西施舌多糖對裸鼠體重增加的影響Table 1 Effect of PCA on weight gain of nude mice

2.2 西施舌多糖對裸鼠人食管鱗癌移植瘤體積的影響

給藥17 d 后，除西施舌大劑量組腫瘤體積與NS 組之間存在顯著差異外，其它實驗組與NS 組比較無顯著差異。給藥20 d 后，西施舌小劑量組與NS 組比較，腫瘤體積無顯著差異。實驗結束后，不同劑量西施舌多糖實驗組與NS 對照組之間腫瘤體積均存在顯著差異，各實驗組腫瘤體積均小于陰性對照組。

圖1 西施舌多糖對裸鼠腫瘤體積的影響Fig.1 Effect of PCA on tumor size in nude mice

2.3 西施舌多糖對人食管癌裸鼠移植瘤抑瘤率的影響

西施舌多糖小劑量組小鼠的瘤重與NS 組比較顯著降低(P＜0.05)，抑瘤率為13.46%。而中劑量組和大劑量組腫瘤重量與NS 組比較均存在極顯著差異(P＜0.01)，抑瘤率分別為22.44% 和28.85%，且西施舌多糖各劑量組中裸鼠的瘤重呈現出劑量-效應關系，提示西施舌多糖對裸鼠EC-9706 細胞移植瘤的生長具有明顯的抑制作用。

表2 西施舌多糖對裸鼠食管癌抑瘤率的影響Table 2 Effect of PCA on tumor inhibition rate of esophagus carcinoma in nude mice

2.4 西施舌多糖對裸鼠脾臟、肝臟的影響

西施舌多糖大劑量組脾臟指數與NS 組比較存在顯著差異，而小劑量組和中劑量組與NS 組比較，脾指數不存在顯著差異。各實驗組裸鼠肝臟重量與NS 組比較，除CTX 組存在極顯著差異外，西施舌多糖各劑量組均無顯著差異(見表3);裸鼠肝臟鏡下觀察，陽性對照組見肝細胞出現大片壞死，而西施舌多糖各劑量組肝細胞均未見明顯形態改變(見圖2)。

表3 西施舌多糖對食管癌裸鼠脾、肝的影響Table 3 Effect of PCA on important organs of tumor-bearing nude mice

圖2 CTX 組(A)、西施舌大劑量組(B)及西施舌中劑量組(C)裸鼠肝臟鏡下觀察(HE×200)Fig.2 Histopathological observation of liver of nude mice of positive control group(A)，PCA high dose group(B)and PCA medium dose group(C)(HE×200)

2.5 移植瘤病理組織學觀察

光鏡下觀察，可見NS 組的腫瘤組織中瘤細胞排列密集成群，呈不規則巢狀分布，瘤細胞多為多邊形，核大深染。而西施舌中、大劑量組及陽性對照組的腫瘤組織中，瘤細胞數較少，分布稀疏，細胞體積變小，核深染，有的細胞固縮，有的僅存胞核，并可見不規則壞死(圖3)。

圖3 NS 組(A)、西施舌中劑量組(B)、西施舌大劑量組(C)及CTX 組(D)的移植瘤病理組織學觀察(HE×200)Fig.3 Histopathological observation of tumor of NS group(A)，PCA medium dose group(B)，PCA high dose group(C)and CTX group(D)

3 討論

食管癌是人類常見的惡性腫瘤之一，我國食管癌發病率和病死率均居世界之首［4］。近十幾年，腫瘤的手術及放化療取得了長足的進步，使患者生存時間明顯延長，但對大部分惡性腫瘤的治療尚未能達到令人滿意的效果。臨床所用的抗癌藥物大多有明顯的毒副作用，而從天然產物提取活性多糖不僅具有顯著抗腫瘤作用，且沒有或很少有常用抗腫瘤化療藥物損傷骨髓、抑制造血的副作用［5］。從天然產物中開發無毒副作用的抗腫瘤活性成分是人類戰勝腫瘤的可能途徑之一。

貝類多糖是存在于貝類體內的一種生物活性物質，結構新穎、功能獨特，有望成為腫瘤治療中新的藥物資源［1］。Liao 等［6］研究表明，從淡水貝類河蜆中提取活性多糖對人胃癌和卵巢癌具有顯著抑制作用。陳倩超［7］研究證實鮑魚多糖具有抑制腫瘤生長，延長S180腹水型小鼠、艾氏腹水型小鼠和肝癌腹水型小鼠壽命，同時認為多糖的抗癌活性與其化學結構，給藥途徑、劑量選擇有密切關系。許東暉［8］等研究也表明，鮑魚多糖能明顯抑制裸鼠移植人鼻咽癌的生長，誘導腫瘤細胞凋亡和壞死，對荷癌裸鼠體重增長無明顯抑制作用，并且未出現毒副作用。文蛤多糖能顯著地降低小鼠的S180實體瘤的重量，可顯著延長艾氏腹水瘤和肝癌腹水瘤荷瘤小鼠的存活時間［9］。另外，從鮑魚、牡蠣、珠母貝、褶紋冠蚌、三角帆蚌等貝類中提取出具抗腫瘤效果的活性多糖［1］。本研究結果顯示，西施舌多糖不僅能有效抑制裸鼠體內食管癌的生長，導致腫瘤細胞凋亡和壞死。同時其抑瘤率隨濃度增大和時間的延長而增加，而且對裸鼠的肝臟重量及其形態沒有影響，說明無明顯的毒副作用。與以上的研究結論相似。

貝類多糖抗腫瘤作用的主要機制與其免疫調節和抗氧化作用有關。免疫調節是目前公認的多糖抗腫瘤作用的主要機制之一［1］。多數多糖具有體內抗腫瘤作用，不僅能激活T、B 淋巴細胞，巨噬細胞，自然殺傷細胞等免疫細胞，還能活化補體，促進細胞因子生成，對免疫系統發揮多方面的調節作用［10，11］。多糖是一種免疫增強劑，許東暉等［8］研究表明鮑魚多糖能明顯增強荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能和遲發型超敏反應。鮑魚多糖通過激活巨噬細胞及T 細胞，直接或間接地促進細胞毒因子的釋放、殺傷腫瘤細胞，從而抑制腫瘤細胞的生長，發揮其抗腫瘤作用。文蛤多糖對環磷酰胺(CTX)造成的小鼠免疫功能損傷有對抗作用，能使外周血液白細胞數量增加，吞噬能力增強，血清溶血素抗體水平增高，免疫器官胸腺、脾臟增重［9］。腫瘤患者常伴隨免疫功能的低下，故提高患者的免疫功能，將有利于機體抗腫瘤。但絕大多數抗腫瘤藥在殺傷腫瘤細胞的同時，對免疫功能也有很大的影響，常引起胸腺指數、脾指數等免疫指標的異常。而西施舌提取物不僅能提高正常小鼠的T-OAC、SOD 和POD 活性，降低MDA 含量，提高小鼠的抗氧化能力［12］。而且本實驗結果顯示，西施舌多糖能顯著抑制裸鼠移植性食管癌的生長，提高裸鼠的免疫器官脾臟的重量。表明西施舌多糖在抑制腫瘤生長的同時具有一定的促進荷瘤動物機體恢復、改善荷瘤動物免疫功能的作用，至于西施舌多糖抗腫瘤作用可能與增強機體免疫活性有關，具體的機制還有待后續進一步深入研究。

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