補(bǔ)腎活血方中單體成分的體外炎性抑制作用研究

孫東東，閆秋瑩，劉麗萍，沈衛(wèi)星，程海波

南京中醫(yī)藥大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心 國(guó)家中醫(yī)藥管理局名醫(yī)驗(yàn)方評(píng)價(jià)與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)研究室 江蘇省抗腫瘤驗(yàn)方研究與產(chǎn)業(yè)化工程實(shí)驗(yàn)室，南京 210023

補(bǔ)腎活血方是南京中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院用于治療骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)的協(xié)定處方，為深入研究補(bǔ)腎活血方治療骨關(guān)節(jié)炎(OA)的效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)及藥效分子機(jī)制，前期試驗(yàn)采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC-MSn)，圍繞復(fù)方進(jìn)行了定性和定量分析［1-3］，確定了復(fù)方中存在的若干化合物，同時(shí)比較了配伍前后相關(guān)成分的含量變化。本研究結(jié)合文獻(xiàn)查閱，選取出5 種在復(fù)方提取液中分離得到，并且文獻(xiàn)報(bào)道有明確或潛在治療OA 活性的單體作為體外炎癥試驗(yàn)對(duì)象，他們分別是芍藥苷［4］、阿魏酸［5］、白藜蘆醇［6］、蛇床子素［7］、補(bǔ)骨脂素［8］。TNF-α、IL-6 及NO是目前已經(jīng)驗(yàn)證的，與炎癥有關(guān)或與OA 相關(guān)的細(xì)胞因子，這些炎性因子在OA 的發(fā)病過(guò)程中起著重要調(diào)節(jié)作用，可以加速關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的分解代謝［9-12］。本實(shí)驗(yàn)采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定芍藥苷等5 種單體成分及復(fù)方水提部位，對(duì)脂多糖(LPS)刺激誘導(dǎo)的RAW264.74 小鼠巨噬細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6、NO 的抑制作用，方法快速、便利、準(zhǔn)確，對(duì)于評(píng)價(jià)和驗(yàn)證復(fù)方OA 治療活性，闡明藥效分子機(jī)制，探究效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)具有重要意義。

1 儀器與試藥

ACQUITY UPLC 系統(tǒng)(四元泵溶劑系統(tǒng)，在線脫氣機(jī)和自動(dòng)進(jìn)樣器，美國(guó)Waters 公司)，Xevo TQ型質(zhì)譜檢測(cè)器(美國(guó)Waters 公司)，MassLynxTM 型質(zhì)譜工作站軟件(美國(guó)Waters 公司)，BT125 型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);EPED 超純水系統(tǒng)(南京易普達(dá)易科技發(fā)展有限公司);TGL16 型低溫高速離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司);RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);SY-1220 型水浴鍋(美國(guó)Crystal 公司);1300SeriesA2 型無(wú)菌操作臺(tái)(美國(guó)Thermo scientific 公司);無(wú)菌CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo scientific 公司);酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo scientific 公司)。

獨(dú)活、桑寄生、懷牛膝、淫羊藿、當(dāng)歸、川芎、白芍、虎杖、制天南星等藥材，均購(gòu)自安徽亳州，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授對(duì)照2010 版藥典(一部)的藥材標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行定性和相關(guān)指標(biāo)定量分析，鑒定為正品;芍藥苷(批號(hào):0736-9811)、阿魏酸(批號(hào):0773-9910)、白藜蘆醇(批號(hào):10040-201201)、蛇床子素(批號(hào):0822-9802)、補(bǔ)骨脂素(批號(hào):739-8701)等標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所;脂多糖(LPS，1 mg/mL，Sigma 公司)、1640 培養(yǎng)基(Gibico公司)、FBS(上海四季青公司)、胰酶(批號(hào):27250018，Gibico 公司)、DMSO(批號(hào):20110105，上海凌風(fēng))、小鼠TNF-α ELISA 試劑盒(批號(hào):EM004-96，規(guī)格96t，上海依科賽生物制品有限公司)、小鼠IL-6 ELISA 試劑盒(批號(hào):EM008-96，規(guī)格96t，上海依科賽生物制品有限公司)、NO ELISA 試劑盒(批號(hào):S0021-2，規(guī)格200t，江蘇碧云天生物技術(shù)研究所);乙腈、甲酸(色譜純，德國(guó)Merk 公司)，水為超純水，其他試劑均為分析純;RAW264.74 小鼠巨噬細(xì)胞(批號(hào):13-00302，上海漢博生物科技有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 LC-MS 樣品制備

獨(dú)活等復(fù)方藥材合并后加入8 倍量水，煎煮3次，時(shí)限分別為1、1、0.5 h，過(guò)濾后合并濾液，95%乙醇沉淀，離心后取上清液濃縮至干，精密稱取0.1000 g 浸膏用50%甲醇定容至200 mL 容量瓶，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，供液質(zhì)連用分析;剩余浸膏供藥效試驗(yàn)使用。

2.2 LC-MS 條件

色譜分離及質(zhì)譜分析檢測(cè)條件參考前面的定性和定量分析實(shí)驗(yàn)相關(guān)參數(shù)［1-3］，取樣錐孔電壓、碰撞能量等5 種化合物的主要質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)參見(jiàn)表1。

表1 5 種化合物的主要質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)Table 1 The main MS detection parameters of 5 targeted compounds

2.3 細(xì)胞鋪板［13］

用1640 培養(yǎng)基+10%FBS 培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.74(培養(yǎng)條件:5% CO2，37℃恒溫培養(yǎng))，待細(xì)胞長(zhǎng)至適量后，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)，稀釋至1×105個(gè)/mL，以200 μL/孔的量鋪至48 孔板中。放入無(wú)菌培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.4 給藥方法及分組

用1640 培養(yǎng)基將LPS 稀釋至500 μg/L，芍藥苷、阿魏酸、白藜蘆醇、蛇床子素、補(bǔ)骨脂素及復(fù)方水提部位等分別用DMSO 溶解使其濃度為1×105μg/mL，而后用培養(yǎng)基將待測(cè)試藥分別稀釋至100、20 μg/mL。吸凈孔中培養(yǎng)基，將稀釋后的試藥依次加入300 μL，實(shí)驗(yàn)分設(shè)陰性對(duì)照組(不加藥)，LPS 對(duì)照組(只加LPS)，芍藥苷組(LPS+20 μg/mL 芍藥苷、LPS+100 μg/mL 芍藥苷)，阿魏酸組(LPS+20 μg/mL 阿魏酸、LPS+100 μg/mL 阿魏酸)，白藜蘆醇組(LPS+20 μg/mL 白藜蘆醇、LPS+100 μg/mL白藜蘆醇)，蛇床子素組(LPS+20 μg/mL 蛇床子素、LPS+100 μg/mL 蛇床子素)，補(bǔ)骨脂素組(LPS+20 μg/mL 補(bǔ)骨脂素、LPS+100 μg/mL 補(bǔ)骨脂素)，復(fù)方水提部位組(LPS+20 μg/mL 復(fù)方水提部位、LPS+100 μg/mL 復(fù)方水提部位);每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔。將48 孔板置于無(wú)菌培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.5 檢測(cè)方法

收集細(xì)胞上清液，在4 ℃下，10 000 rpm 離心2 min 后，吸取上清液，按照說(shuō)明書(shū)中檢測(cè)步驟處理上清液，最后用酶標(biāo)儀以450 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)，檢測(cè)TNF-α、IL-6 水平;以540 nm 為波長(zhǎng)，檢測(cè)NO 水平。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品OD 值計(jì)算樣品細(xì)胞因子濃度，并記錄。

2.6 數(shù)據(jù)計(jì)算及統(tǒng)計(jì)分析

抑制率(%)=100%-(加藥組C 值-空白對(duì)照C值)/(LPS 組C 值-空白組C 值)(C 為細(xì)胞因子濃度);應(yīng)用SPSS 12.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組檢測(cè)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 補(bǔ)腎活血方中化合物的檢測(cè)

結(jié)合LC-MS 測(cè)定，通過(guò)軟件積分，文獻(xiàn)比對(duì)和數(shù)據(jù)分析，確定補(bǔ)腎活血方中確實(shí)存在芍藥苷、阿魏酸、白藜蘆醇、蛇床子素及補(bǔ)骨脂素等化合物。

3.2 對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.74 細(xì)胞釋放TNF-α，IL-6 及NO 的抑制作用

對(duì)根據(jù)酶標(biāo)儀所測(cè)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，與空白組比較，模型組TNF-α、IL-6、NO 含量明顯升高(P＜0.01);與模型組比較，阿魏酸、白藜蘆醇及補(bǔ)骨脂素在100 μg/mL，以及蛇床子素在20、100 μg/mL 均對(duì)TNF-α 的釋放具有顯著的抑制(P＜0.01)，并且它們的最高抑制率強(qiáng)于復(fù)方水提部位;阿魏酸及補(bǔ)骨脂素在100 μg/mL，白藜蘆醇及蛇床子素在20、100 μg/mL 均對(duì)IL-6 水平具有顯著的抑制(P＜0.01)，并且它們的最高抑制率強(qiáng)于復(fù)方水提部位;芍藥苷在100 μg/mL，阿魏酸、白藜蘆醇、蛇床子素及補(bǔ)骨脂素在20、100 μg/mL 均對(duì)NO 的釋放具有顯著抑制(P＜0.01)，并且阿魏酸、白藜蘆醇、蛇床子素、補(bǔ)骨脂素的最高抑制率均強(qiáng)于復(fù)方水提部位。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)看，樣品濃度與TNF-α、IL-6 及NO 的釋放抑制率基本是呈正相關(guān)系，僅發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂素在20 μg/mL 濃度時(shí)對(duì)于 NO 釋放的抑制率為93.46%，大于在100 μg/mL 濃度時(shí)的抑制率81.31%，該現(xiàn)象有待進(jìn)一步探究其原因。實(shí)驗(yàn)具體數(shù)據(jù)與結(jié)果見(jiàn)表2～4。

表2 復(fù)方中5 種單體對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.74 細(xì)胞釋放TNF-α 的抑制作用Table 2 The inhibition effects of 5 components in recipe on TNF-α released by LPS-induced RAW264.74 cell

注:±s，n=3，加藥組與LPS 模型對(duì)照組比較，* P＜0.05，＊＊P＜0.01。Note:±s，n=3，compared with LPS group，* P＜0.05，＊＊P＜0.01.

表3 復(fù)方中5 種單體對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.74 細(xì)胞釋放IL-6 的抑制作用Table 3 The inhibition effects of 5 components in recipe on IL-6 released by LPS-induced RAW264.74 cell

表4 復(fù)方中5 種單體對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.74 細(xì)胞釋放NO 的抑制作用Table 4 The inhibition effects of 5 components in recipe on NO released by LPS-induced RAW264.74 cell

4 討論

TNF-α 可激活多型棱細(xì)胞，刺激滑膜細(xì)胞的PGE 產(chǎn)生，增加骨、軟骨的破壞。鄧康夫等通過(guò)對(duì)TNF-α 的研究指出，TNF-α 以促滑膜成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞增殖作用為主，并因其增強(qiáng)滑膜細(xì)胞RNA 的表達(dá)功能，而使滑膜組織纖維性變大及滑液中細(xì)胞因子水平異常升高，從而改變關(guān)節(jié)的力學(xué)特征和軟骨細(xì)胞的生活微環(huán)境，而成為參與OA 關(guān)節(jié)軟骨退變的途徑之一［9］。IL-6 又稱B 細(xì)胞分化因子，其作用與B 細(xì)胞功能相關(guān)聯(lián)，IL-6 可激活B 細(xì)胞和T 細(xì)胞，通過(guò)其自分泌形式作用于軟骨細(xì)胞，促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖［10］。NO 是多種細(xì)胞因子的信號(hào)分子，介導(dǎo)它們發(fā)揮生物學(xué)作用。正常情況下，NO 起著宿主防疫作用，但過(guò)量的NO 可導(dǎo)致各種慢性炎癥。OA 發(fā)病早期，受損裸露的軟骨細(xì)胞在周?chē)?xì)胞因子的作用下誘發(fā)誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)蛋白表達(dá)，從而導(dǎo)致NO 大量釋放。NO 又進(jìn)一步促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子釋放，從而抑制軟骨細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)和合成Ⅱ型膠原，影響軟骨的營(yíng)養(yǎng)交換，使軟骨處在一個(gè)不良的微環(huán)境中，最終導(dǎo)致軟骨質(zhì)量不斷下降和進(jìn)行性退化［11］。作為具有明確功能和效應(yīng)的炎癥介質(zhì)，抑制細(xì)胞TNF-α、IL-6 及NO 的釋放水平，對(duì)于緩解炎癥癥狀、控制炎癥進(jìn)程具有重要意義。

復(fù)方中的多種成分對(duì)于TNF-α、IL-6 及NO 的釋放顯示了不同程度的抑制作用，這正驗(yàn)證了中藥藥效以及復(fù)方治療的多靶點(diǎn)效應(yīng);復(fù)方其他的提取部位以及廢棄的醇沉部位是否具有炎癥因子釋放抑制效應(yīng)，這是我們活性實(shí)驗(yàn)需要補(bǔ)充努力的方向，為復(fù)方的多功能、不同藥效找到科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù);此外對(duì)于這些部位或成分還可以探索開(kāi)展針對(duì)其他炎性因子的抑制效應(yīng)研究，為更深層次的藥理藥效評(píng)價(jià)、作用機(jī)制分析提供支撐;另外補(bǔ)骨脂素在20 μg/mL的實(shí)驗(yàn)濃度時(shí)對(duì)于NO 的釋放抑制率為93.46%，大于在100 μg/mL 濃度時(shí)的抑制率81.31%，其是否屬于實(shí)驗(yàn)誤差，還是具有雙向調(diào)節(jié)機(jī)制作用，需要進(jìn)一步探究其原因。

目前臨床上治療OA，主要采用非甾體抗炎藥、鎮(zhèn)痛劑以及關(guān)節(jié)注射透明質(zhì)酸鈉等手段，但是實(shí)際療效往往并不理想，經(jīng)常加重OA 的發(fā)病程度，延長(zhǎng)病情;補(bǔ)腎補(bǔ)血方作為一個(gè)治療OA 的臨床驗(yàn)方，實(shí)踐證明其療效確切、安全可行;OA 從中醫(yī)的角度應(yīng)歸于痹癥范疇，痹癥往往伴隨大量的炎癥反應(yīng)，所以說(shuō)如何有效結(jié)合中醫(yī)的病機(jī)研判，從治則、治法等角度，通過(guò)藥效實(shí)驗(yàn)，揭示復(fù)方治療和干預(yù)的協(xié)同機(jī)制。反證中醫(yī)的病機(jī)理論，提升完善中醫(yī)理論，較好地達(dá)到醫(yī)藥結(jié)合，中藥研究與中醫(yī)理論的科學(xué)呼應(yīng)，這也是我們復(fù)方研究下一步的重點(diǎn)和方向。

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