芒果苷代謝產物的合成及黃嘌呤氧化酶抑制活性研究

楊 華，徐鎮平，何夢婷，何嚴萍，李 玲，宋流東*

1 昆明醫科大學生物醫學工程研究中心，昆明 650500;2昆明醫科大學第二附屬醫院，昆明 650101;3 云南大學化學科學與工程學院，昆明 650091

芒果苷(mangiferin)系四羥基吡酮的碳糖苷、屬雙苯吡酮類化合物，前期研究發現它具有較強降低高尿酸血癥小鼠血尿酸作用，與臨床一線抗痛風藥別嘌醇相比，具有效價高而毒性低的特點［1］。然而研究表明芒果苷的生物利用度很低，大鼠經口給藥的生物利用度僅為1.2%［2］，難以解釋它較強的體內降尿酸作用，因而推測它的降尿酸作用與它的代謝產物有關。

研究表明1，3，6，7-四羥基氧雜蒽酮(2)為芒果苷在消化道內的主要代謝產物，由腸道細菌分解它而得［3］，吸收后再進一步代謝為其它代謝物［4］;而1，3，7-三羥基氧雜蒽酮(3)則是它被吸收后經尿液排出最多的一個代謝產物［4］。由于從給藥動物體內獲得芒果苷代謝產物甚微，本研究采用化學方法合成了它的兩個主要代謝產物2、3，并以尿酸生成的關鍵酶黃嘌呤氧化酶為靶點，研究2、3 及合成中間體4、5、6、7 對黃嘌呤氧化酶活性的影響，探討代謝產物在芒果苷降尿酸作用中的地位，為詮釋它的降尿酸作用提供實驗和理論依據。

圖1 芒果苷、代謝產物以及合成中間體的化學結構Fig.1 Chemical structures of mangiferin，its metabolites and their synthetic precursors

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

2，4，5-三甲氧基苯甲酸、2，5-二甲氧基苯甲酸、1，3，5-三甲氧基苯、黃嘌呤氧化酶、黃嘌呤鈉鹽、焦磷酸鈉、別嘌醇和EDTA 均為Sigma 公司產品;芒果苷由昆明醫科大學生物醫學工程中心提供，純度＞95%(HPLC);別嘌醇片系廣東彼迪藥業有限公司產品，氧嗪酸鉀為山東中科泰斗化學有限公司生產，其余試劑均為國產分析純。

1.1.2 實驗動物

SPF 級KM 小鼠，雄性，體重18～22 g，購自昆明醫科大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號:SCXK(滇)2005-0008。

1.1.3 實驗儀器

熔點用四川大學科儀廠XRC-1 顯微熔點測定儀測定;NMR 用Bruker DRX-400MHz 型核磁共振儀測定;BioTek 全波長紫外-可見光酶標儀型號:PowerWave XS。

1.2 方法

1.2.1 代謝產物1，3，6，7-四羥基氧雜蒽酮(2)的合成

參照文獻［5］方法合成了1，3，6，7-四羥基氧雜蒽酮(2)及中間體2，2'，4，4'，5'，6-六甲氧基二苯甲酮(4)和1，3，6，7-四甲氧基氧雜蒽酮(5)。

1.2.2 代謝產物1，3，7-三羥基氧雜蒽酮(3)的合成

圖2 1，3，7-三羥基氧雜蒽酮合成圖Fig.2 Scheme for synthesis of 1，3，7-trihydroxyxanthone

1.2.2.1 中間體2，2'，4，5'，6-五甲氧基二苯甲酮(6)的合成

［6-8］方法，在50 mL 圓底燒瓶中加入2，5-二甲氧基苯甲酸1.000 g(5.49 mmol)、苯30 mL、氯化亞砜7 mL，干燥回流10 h，減壓除去溶劑，得淡棕色油狀物(2，5-二甲氧基苯甲酰氯);其中加入乙醚30 mL、1，3，5-三甲氧基苯0.930 g(5.54 mmol)，在冰水浴中溶解后分批加入三氯化鋁1.200 g，室溫攪拌22 h;反應物中加入冰水40 mL、濃鹽酸3 mL，攪拌均勻后用氯仿萃取，無水硫酸鎂干燥，過濾濃縮后過硅膠柱，石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯(11∶2∶1)洗脫，得中間體2，2'，4，5'，6-五甲氧基二苯甲酮(6)0.820 g(2.47 mmol，收率45.0%)。

1.2.2.2 中間體1，3，7-三甲氧基氧雜蒽酮(7)的合成

在50 mL 圓底燒瓶中加入2，2'，4，5'，6-五甲氧基二苯甲酮(6)0.500 g(1.51 mmol)、無水二氯甲烷10 mL，在10 ℃水浴中攪拌并加入1 M 三氯化硼二氯甲烷溶液10 mL，繼續攪拌20 min，將其倒入50 mL 冰水中攪拌至溶液呈黃色，有機層用無水硫酸鎂干燥，濃縮后過硅膠柱，石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯(12∶1∶1)洗脫，得2'-羥基-2，4，5'，6-四甲氧基二苯甲酮或2-羥基-2'，4，5'，6-四甲氧基二苯甲酮。

在100 mL 圓底燒瓶中加入上述所得全部2'-羥基-2，4，5'，6-四甲氧基二苯甲酮或2-羥基-2'，4，5'，6-四甲氧基二苯甲酮，再加入吡啶20 mL、水10 mL和25%的四甲基氫氧化銨(簡稱TMAOH)水溶液15 mL，回流16 h，酸化后氯仿萃取，無水硫酸鎂干燥，濃縮后過硅膠柱，石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯(20∶6∶1～2∶1∶1)洗脫，得中間體1，3，7-三甲氧基氧雜蒽酮(7)0.144 g(0.50 mmol，收率33.1%)。

1.2.2.3 代謝產物1，3，7-三羥基氧雜蒽酮(3)的合成

在50 mL 圓底燒瓶中加入1，3，7-三甲氧基氧雜蒽酮(7)0.100 g(0.35 mmol)、苯酚10 mL、氫碘酸5 mL，160 ℃油浴回流7 h，反應液倒入150 mL、4.7%的亞硫酸氫鈉水溶液中攪拌，過濾、干燥后用熱甲醇溶液溶解，再過濾去雜質，濾液濃縮后過硅膠柱，石油醚-丙酮(4∶1)洗脫，得代謝產物1，3，7-三羥基氧雜蒽酮(3)0.068 g(0.28 mmol，收率80.0%)。

1.2.3 芒果苷及其代謝產物對黃嘌呤氧化酶活性的影響

參照文獻方法［9-11］體外測定芒果苷及其代謝產物對黃嘌呤氧化酶活性的影響，即在96 孔紫外檢測板中加入黃嘌呤氧化酶(8 U/L)和系列濃度的受試化合物或陽性對照藥別嘌醇，于25 ℃預溫15 min，加入黃嘌呤(160 μmol/L)啟動反應，25 ℃反應30 min，加入1N HCl 14.5 μL 終止反應，于全波長紫外-可見光酶標儀在295 nm 下測定紫外吸光度(OD)，按下式計算抑制率，用GraphPad 5.0 軟件計算IC50值。

酶活性抑制率%=［酶組OD 值-(樣品組OD值-樣品本底OD 值)］/(酶組OD 組-空白OD 值)×100%

1.2.4 芒果苷及其代謝產物的降尿酸作用

雄性KM 小鼠50 只，體重18～22 g，適應性飼養后，隨機分為5 組，每組10 只，即:正常對照組、高尿酸血癥模型對照組、芒果苷組、代謝產物2 組(1.85 mg/kg)和陽性對照藥別嘌醇組(1.0 mg/kg)，分別給予等體積溶媒(0.5% CMC-Na)、芒果苷3.0 mg/kg、代謝產物21.85 mg/kg 和陽性對照藥別嘌醇1.0 mg/kg，均按10 mL/kg 灌胃給藥，每天2次，共5 次，末次給藥前1 h 一次性腹腔注射尿酸氧化酶抑制劑氧嗪酸鉀450 mg/kg，造成高尿酸血癥小鼠模型［11，12］，正常對照組則注射等體積0.5%CMC-Na 溶液，注射體積為20 mL/kg，給藥后1 h 小鼠眼球后靜脈叢取血，3500 rpm 常溫離心10 min，取血清，采用磷鎢酸法測定血清尿酸水平。數據用均數±標準差表示，用GraphPad 5.0 軟件做t-檢驗進行統計學處理。

2 實驗結果

2.1 代謝產物2、3 和合成中間體4、5 的結構表征

代謝產物2、3 和合成中間體4、5 的結構表征與文獻［5-8］報道一致。

2.2 合成中間體6、7 的結構表征

中間體6:淡黃色固體，收率45.0%，mp.86～90 ℃;1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:7.24(s，1H，CH)，6.99(d，J=8 Hz，H，CH)，6.86(d，J=8 Hz，H，CH)，6.11(s，2H，2CH)，4.02(s，3H，CH3)，3.76(s，3H，CH3)，3.66(s，3H，CH3)，3.63(s，3H，CH3)，3.56(s，3H，CH3);13C NMR(CDCl3，400 MHz)δ:193.1，162.0，158.6，153.8，153.2，129.8，119.4(CH)，115.6(CH)，114.2(CH)，90.6(CH)，57.0(CH3)，55.8(CH3)，55.7(CH3)，55.3(CH3)。

中間體7:黃色固體，收率33.1%，mp.138～142 ℃;1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:7.67(d，J=2.8 Hz，1H，CH)，7.30(d，J=8.8 Hz，1H，CH)，7.22(dd，J=2.8，3.2 Hz，1H，CH)，6.46(d，J=2 Hz，1H，CH)，6.31(d，J=2 Hz，1H，CH)，3.96(s，3H，CH3)，3.89(s，3H，CH3)，3.88(s，3H，CH3);13C NMR(CDCl3，400 MHz)δ:175.2，164.7，161.8，159.7，155.8，149.5，123.3，123.2(CH)，118.2(CH)，106(CH)，94.9(CH)，92.5(CH)，56.3(CH3)，55.8(CH3)，55.7(CH3)。

2.3 芒果苷及其代謝產物對黃嘌呤氧化酶活性的影響

研究結果表明芒果苷代謝產物2 具有較強的黃嘌呤氧化酶抑制作用，且呈現出濃度依賴性，其IC50為10.89 μM，合成2 的中間體5、代謝產物3、合成3的中間體7 也有一定的抑制活性，在終濃度為87.3 μM 時，抑制率分別為45.8、52.1 和32.1%，均弱于2;在此濃度下，中間體4、6 和芒果苷對黃嘌呤氧化酶的活性沒有明顯的抑制作用;陽性對照藥別嘌醇則濃度依賴性的抑制黃嘌呤氧化酶活性，其IC50為2.95 μM(表1)。

2.4 芒果苷及其代謝產物對高尿酸血癥小鼠血尿酸的影響

研究結果表明模型組動物腹腔注射尿酸酶抑制劑氧嗪酸后，血清尿酸水平顯著高于正常對照組，差異有統計學意義(P＜0.01)，提示模型復制成功。灌胃給予高尿酸血癥小鼠芒果苷和代謝產物2 后，均顯著降低高尿酸血癥小鼠的血清尿酸水平，與模型對照組相比，有顯著性差異(P＜0.05);芒果苷與等摩爾劑量的代謝產物2 相比，差異無統計學意義，提示芒果苷和代謝產物2 降尿酸作用的效價相當(表2)

表1 芒果苷及其代謝產物對黃嘌呤氧化酶活性的影響(±s，n=4)Table 1 Inhibition effects of mangiferin and its metabolites on xanthine oxidase activity(±s，n=4)

表1 芒果苷及其代謝產物對黃嘌呤氧化酶活性的影響(±s，n=4)Table 1 Inhibition effects of mangiferin and its metabolites on xanthine oxidase activity(±s，n=4)

表2 芒果苷及代謝產物7 灌胃給藥對氧嗪酸鉀誘導高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平的影響(±s，n=10)Table 2 Effect of mangiferin and its metabolites on serum urate levels in potassium oxonate-induced hyperuricemic mice(±s，n=10)

表2 芒果苷及代謝產物7 灌胃給藥對氧嗪酸鉀誘導高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平的影響(±s，n=10)Table 2 Effect of mangiferin and its metabolites on serum urate levels in potassium oxonate-induced hyperuricemic mice(±s，n=10)

注:與正常組比較，* P＜0.01;與模型對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01(t-test 檢驗)。Note:Compare with control group，* P＜0.01;Compare with model group，#P＜0.05，##P＜0.01(t-test).

3 討論

在代謝產物3 的合成過程中，2'-羥基-2，4，5'，6-四甲氧基二苯甲酮或2-羥基-2'，4，5'，6-四甲氧基二苯甲酮合環時，參考文獻［8］方法用2M 氫氧化鈉水溶液或氫氧化鉀水溶液、吡啶、甲醇回流，反應效果不好，有許多原料沒有反應完;當參考文獻［6，7］方法改用10%或25%的四甲基氫氧化銨水溶液、吡啶-水(1∶1 或2∶1)反應，產物生成較多，結果好得多，而且用25%的四甲基氫氧化銨水溶液比用10%的四甲基氫氧化銨水溶液結果更好，吡啶-水(2∶1)也比吡啶-水(1∶1)反應結果好一些，提示水的用量可能越少越好，其相關性需要進一步研究。

黃嘌呤氧化酶作為嘌呤代謝的關鍵酶，其活性增高是形成高尿酸血癥的主要原因，因而成為治療痛風和高尿酸血癥的重要靶點［13］。目前臨床使用的黃嘌呤氧化酶抑制劑別嘌醇和非布索坦即是通過抑制黃嘌呤氧化酶活性，阻斷了尿酸的生成，有效降低血清尿酸水平，從而達到預防和治療痛風或高尿酸血癥的目的。本研究以此為靶點，探討芒果苷代謝產物對黃嘌呤氧化酶活性的影響，結果表明芒果苷的代謝產物2 和3 均具有黃嘌呤氧化酶抑制作用，2 的活性更強，IC50為10.89 μM。3 與2 相比，碳6 位上少一個羥基，在濃度為87.3 μM 時，其活性降低了39.3%;當羥基被甲氧基取代后(5、7)，抑制活性也明顯降低，吡喃環開環后(4、6)則黃嘌呤氧化酶的抑制作用喪失，提示芒果苷代謝產物抑制黃嘌呤氧化酶活性的核心結構應該是母核氧雜蒽酮(即雙苯吡酮)，羥基的位置和數量對維持黃嘌呤氧化酶抑制作用也具有重要作用。

鑒于代謝產物3 抑制黃嘌呤氧化酶的活性低于2，且3 積累的量有限，因此選擇代謝產物2 進行體內降尿酸作用研究。研究表明等分子的芒果苷和代謝產物2 灌胃給藥后其降低高尿酸血癥小鼠血尿酸作用的效價相當，說明代謝產物2 可能是芒果苷降尿酸作用的主要代謝產物，通過抑制黃嘌呤氧化酶活性，減少了尿酸的生成，從而改善高尿酸血癥。然而，文獻報道芒果苷進入體內后的代謝很復雜，能分解出較多的代謝產物［4，14］，這些代謝產物是否都具有黃嘌呤氧化酶抑制活性尚需進一步實驗證明。

參考文獻

1 Han DD，Chen CJ，Zhang C，et al.Determination of mangiferin in rat plasma by liquid-liquid extraction with UPLCMS/MS.J Pharm Biomed Anal，2010，51:260-263.

2 Niu YF，Lu W，Gao LH，et al.Reducing effect of mangiferinon serum uric acid levels in mice.Pharm Biol，2012，50:1177-1182.

3 Sanugul K，Akao T，Li Y，et al.Isolation of a human intestinal bacterium that transforms mangiferin to norathyriol and inducibility of the enzyme that cleaves a C-glucosyl bond.Biol Pharm Bull，2005，28:1672-1678.

4 Wang H，Ye G，Ma CH，et al.Identification and determination of four metabolites of mangiferin in rat urine.J Pharm Biomed Anal，2007，45:793-798.

5 Xu ZP(徐鎮平)，Song LD(宋流東).Total synthesis of 1，3，6，7-tetrahydroxyxanthone of metabolites from mangiferin.J Kunming Med Univ(昆明醫科大學學報)，2012，5:64-65.

6 Hu HG，Liao HL，Zhang J，et al.First identification of xanthone sulfonamides as potent acyl-CoA:cholesterol acyltransferase(ACAT)inhibitors.Bioorg Med Chem Lett，2010，20:3094-3097.

7 Lin CN，Liou SS，Ko FN，et al.Gamma-pyrone compounds.II:Synthesis and antiplatelet effects of tetraoxygenated xanthones.J Pharm Sci，1992，81:1109-1112.

8 Mondal M，Puranik VG，Argade NP.Facile synthesis of 1，3，7-trihydroxyxanthone and its regioselective coupling reactions with prenal:simple and efficient access to osajaxanthone and nigrolineaxanthone F.J Org Chem，2006，71:4992-4995.

9 Zhu SY(朱深銀)，Zhou YD(周遠大)，Liu QS(劉慶山)，et al.Establishment and application of a high-throughput screening assay for xanthine oxidase inhibitor in vitro.Chin Pharm J(中國藥學雜志)，2007，42:187-189.

10 Ozyurek M，Bektasoglu B，Guclu K，et al.Measurement of xanthine oxidase inhibition activity of phenolics and flavonoids with a modified cupric reducing antioxidant capacity(CUPRAC)method.Anal Chim Acta，2009，636:42-50.

11 Niu YF，Zhu HJ，Liu J，et al.3，5，2'，4'-Tetrahydroxychalcone，a new non-purine xanthine oxidase inhibitor.Chem-Biol Interact，2011，189:161-166.

12 Hall IH，Scoville JP，Reynolds DJ，et al.Substituted cyclic imides as potential anti-gout agents.Life Sci，1990，46:1923-1927.

13 Whelton A.Current and therapeutic options for the management of gout.Am J Ther，2010，17:402-417.

14 Liu HH，Wang K，Tang YH，et al.Structure elucidation of in vivo and in vitro metabolites of mangiferin.J Pharm Biomed Anal，2011，55:1075-1082.