大鼠灌胃清熱養心顆粒后血漿中咖啡酸、綠原酸藥代動力學研究

吳 磊陸 超居文政

（1.南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇南京210029；2.南京中醫藥大學，江蘇南京210029）

大鼠灌胃清熱養心顆粒后血漿中咖啡酸、綠原酸藥代動力學研究

吳 磊1，2陸 超1居文政1

（1.南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇南京210029；2.南京中醫藥大學，江蘇南京210029）

目的：建立大鼠灌胃清熱養心顆粒后血漿中咖啡酸、綠原酸的UPLC-MS/MS測定方法，并用于其在大鼠體內的藥代動力學研究。方法：SD大鼠6只，灌胃清熱養心顆粒2g/kg，以阿魏酸為內標，用UPLC-MS/MS法測定給藥后血漿中的藥物濃度，并用DAS1.0軟件計算藥動學參數。結果：咖啡酸、綠原酸的線性范圍分別為25～800ng/mL（r=0.9965）、11.25～1440ng/mL（r=0.9949）。方法學考察均符合要求。日內、日間變異系數（RSD）均小于9.8%，精密度和準確度等均符合生物樣品分析的要求。大鼠體內咖啡酸藥代動力學參數：T1/2β為（180.42±25.54）min，AUC0-t為（155397.53±3059.14）ng·min·mL-1，Cmax為（729.43±24.56）ng/mL；綠原酸藥代動力學參數：T1/2β為（115.94±16.12）min，AUC0-t為（191710.99±7263.26）ng·min·mL-1，Cmax為（1110.32±115.33）ng/mL。結論：建立的UPLC-MS/MS分析方法準確靈敏，適于咖啡酸、綠原酸的藥代動力學研究。

清熱養心顆粒 綠原酸 咖啡酸 藥代動力學 UPLC-MS/MS SD大鼠

清熱養心顆粒是江蘇省中醫院的院內制劑，具有清熱解毒、養心安神的功效。此方由金銀花、黃連、酒黃精、百合、山豆根、甘草等組成，臨床可用于治療邪毒侵心型、心氣虛弱型和氣陰兩虛型病毒性心肌炎[1-3]。酚酸類成分為清熱養心顆粒中主要有效成分，現代藥理研究表明，清熱養心顆粒中咖啡酸、綠原酸等酚酸類成分有顯著的抗炎、抗氧化、抗凝血等多種生物活性[4-6]，且綠原酸也是該制劑的指標性成分[7]。但有關清熱養心顆粒有效成分藥代特性方面的研究還未見報道。為深入了解清熱養心顆粒藥代動力學行為，本研究建立了清熱養心顆粒中酚酸類成分綠原酸和咖啡酸血藥濃度檢測方法，方法穩定、可靠，成功應用于藥代動力學研究，現報道如下。

1 實驗材料

1.1 試藥 清熱養心顆粒 （江蘇省中醫院醫院制劑，批號:201203001、201207002、201307001）；對照品咖啡酸（批號:110885-200102）、綠原酸（批號: 110753-200413）和阿魏酸（批號:110773-201313）均購于中國藥品生物制品檢定所。水為超純水，甲酸、甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器 Agilent 1290超高效液相色譜儀；Agilent G6430 LC-MS三重四級桿質譜儀，配有電噴霧化離子源（ESI）；色譜工作站:MassHunter；AE240電子天平 （上海梅特勒-托利多有限公司）；MICRO-17R冷凍離心機（美國Thermo公司）；WH-2微型旋渦混合儀 （上海滬西分析儀器廠）；Drict-Q5超純水機（法國Millipore公司）。

1.3 動物 SD大鼠，雌雄各半，6只，體質量250～270g，由南京中醫藥大學實驗動物中心提供，合格證號:SCXK（浙）2008-0033。

2 實驗方法

2.1 色譜及質譜檢測條件 Agilent ZOBAX SB C18色譜柱 （2.1mm×150mm，5μm）；流動相:甲醇（2mmol/L）-醋酸銨水溶液（80∶20）；流速:200μL/min；柱溫:35℃。離子源:ESI；離子化模式:負離子；定量模式:多反應檢測模式（MRM）；毛細管電壓:3500V；干燥氣溫度:400℃；綠原酸的Fragmentor及CE值分別為90V、10V；咖啡酸的Fragmentor及CE值分別為90V、10V；阿魏酸的 Fragmentor及 CE值分別為80V、10V；檢測對象:綠原酸m/z 353→m/z 191；咖啡酸m/z 179→m/z 135；阿魏酸m/z 193.1→m/z 134.0。2.2 對照品溶液的配制 精密稱取適量綠原酸對照品，用甲醇定容，配制成濃度為1.40mg/mL的儲備液；精密吸取適量，用甲醇分別稀釋成112.5、450、900、3600、14400ng/mL的系列標準溶液。精密稱取適量咖啡酸對照品，用甲醇配制成濃度為1.60mg/mL的儲備液；精密吸取適量，用甲醇分別稀釋成250、500、2000、4000、8000ng/mL的系列標準溶液。以上溶液于4℃保存，備用。

2.3 內標物溶液的配制 精密稱取適量阿魏酸對照品，用甲醇定容并稀釋成550ng/mL，于4℃保存，備用。

2.4 血漿樣品處理 取血漿樣品100μL，加入550ng/mL阿魏酸溶液（內標）20μL，1mol/L鹽酸溶液50μL，渦旋30s，再加入乙酸乙酯800μL，渦旋振搖3min，12000r/min離心5min。取上清液750μL，40℃氮氣流吹干，加100μL50%甲醇復溶，12000r/min離心5min，取上清液2μL進樣分析。

2.5 給藥劑量的確定 清熱養心顆粒臨床給藥劑量為每次10～20g，2次/d。人的平均體重按60kg計算，則其臨床給藥劑量為0.33～0.67g/kg。按大鼠每千克體重的臨床等效量是人的6倍計算，則清熱養心顆粒大鼠灌胃劑量為2～4g/kg，經預實驗，確定大鼠給藥劑量為2g/kg。

2.6 藥代動力學研究 SD大鼠6只，給藥前12h禁食不禁水，分別口服清熱養心顆粒2g/kg。于給藥前及給藥后 10min、20min、30min、1h、1.5h、2h、3h、4h、6h、8h、10h和 12h經眼眶后靜脈叢取血約0.3mL，置于肝素化試管中，以 4000r/min離心10min，取上層血漿于-40℃保存待測。

2.7 數據處理 大鼠靜脈給藥后測得的血藥濃度（C）-時間（T）數據應用DAS 1.0軟件進行處理。選擇適宜的數學模型擬合，計算藥代動力學參數。

3 實驗結果

3.1 專屬性實驗 在本實驗所采用的UPLC-MS/ MS條件下，咖啡酸、綠原酸和阿魏酸的保留時間分別為1.14min、1.06min、1.16min。咖啡酸、綠原酸和內標互不干擾，峰形良好，無雜峰干擾，基線平穩，見圖1。

3.2 標準曲線制備 取空白血漿100μL，分別加入綠原酸、咖啡酸對照品系列標準溶液各10μL，配制成相當于綠原酸及咖啡酸血漿質量濃度分別為11.25、45、90、360、1440ng/mL和25、50、200、400、800ng/mL的血漿樣品。按“血漿樣品處理”項下操作，取2μL進樣分析。以各成分峰面積與內標峰面積的比值Y對血漿質量濃度X進行線性回歸運算，求得的回歸方程即為標準曲線。綠原酸回歸方程: Y=2.3419X+0.0442（r=0.9949），定量下限為10.9ng/mL?？Х人峄貧w方程:Y=4.5936X+0.3382（r=0.9965），定量下限為25ng/mL。

3.3 準確度和精密度 取空白血漿100μL，按“血漿樣品處理”項下制備綠原酸和咖啡酸低、中、高3個濃度（綠原酸血漿質量濃度為45、90、360ng/mL；咖啡酸血漿質量濃度為50、200、400ng/mL）的質量控制（QC）樣品，每個濃度平行做5份，連續測定3d。根據隨性標準曲線求得實測濃度。實測濃度的RSD即為精密度，加入濃度和實測濃度的比值即為準確度。結果表明，綠原酸日內、日間準確度分別為95.2%～103.7%（RSD≤7.4%，n= 5）和92.5%～105.7%（RSD≤9.4%，n=15）；咖啡酸日內、日間準確度分別為94.5%～107.2%（RSD≤7.9%，n=5）和98.2%～108.1%（RSD≤9.8%，n=15）。實驗結果符合生物樣品分析方法的要求。

3.4 提取回收率 取空白血漿100μL，配制“準確度和精密度”項下低、中、高3個不同濃度含藥血漿質控樣品，按上述“血漿樣品處理”項下操作后進樣分析，以血漿中綠原酸、咖啡酸的峰面積與相應質量濃度對照品溶液中綠原酸、咖啡酸峰面積的比值計算出上述3種質量濃度的提取回收率，每個濃度平行做5份。經UPLC-MS/MS測定后，低、中、高3種濃度下的提取回收率分別為:綠原酸，（86.1± 3.9）%、（87.2±5.2）%和 （90.8±8.4）%；咖啡酸，（84.4±4.4）%、（87.9±5.0）%和（85.6±5.3）%。采用同樣的方法考察了內標的提取回收率為 （84.3± 4.6）%。

3.5 穩定性考察 取空白血漿100μL，配制“準確度和精密度”項下低、中、高3個不同濃度含藥血漿質控樣品，按“血漿樣品處理”項下操作方法處理樣品。考察含藥血漿樣品處理好后溶液中分析物在室溫放置24h、含藥血漿樣品-20℃反復凍融3次、含藥血漿樣品-40℃長期冷凍28d的穩定性，每個濃度平行3份。結果表明，經處理后的血漿樣品室溫放置24h后綠原酸及咖啡酸血藥濃度的RSD均小于9.7%，-40℃保存 28d血藥濃度的 RSD均小于10.9%，經過3個凍融周期后兩個分析物的血藥濃度RSD均小于8.7%。

圖1 樣品的液-質聯用離子流圖（A.空白血漿樣品；B.混合對照品；C.血漿樣品；1.綠原酸；2.阿魏酸；3.咖啡酸）

3.6 介質效應考察 取離心管數只，分別精密加入低、中、高3個濃度綠原酸對照品標準溶液（450，900，3600ng/mL）及咖啡酸對照品標準溶液（500，2000，4000ng/mL）各10μL，再分別加入內標替硝唑溶液20μL，水60μL，旋渦1min，于12000r/min離心5min，進行UPLC-MS/MS分析，進樣量2μL，記錄峰面積A1。除不加內標外，另按“血漿樣品處理”項下操作提取空白血漿數管，揮干后同上操作，記錄峰面積A2。A1和A2的比值（A2/A1×100%）即為介質效應ME（%）。綠原酸及咖啡酸血漿樣品低、中、高3種濃度LC-MS/MS介質效應 （n=3）分別為88.43% 、83.93% 、90.76% 和 91.36% 、93.22% 、89.46%，內標阿魏酸介質效應（n=9）為84.17%。

3.7 大鼠體內藥代動力學 大鼠單劑量（2g/kg）灌胃清熱養心顆粒后綠原酸和咖啡酸的血藥濃度-時間曲線見圖2。所測數據使用DAS 1.0軟件進行處理，主要藥動學參數見表1。由結果分析可知，綠原酸和咖啡酸在大鼠體內的藥動學符合二室開放模型。

表1 大鼠灌胃清熱養心顆粒后咖啡酸和綠原酸的藥動學參數（±s，n=6）

表1 大鼠灌胃清熱養心顆粒后咖啡酸和綠原酸的藥動學參數（±s，n=6）

藥動學參數 咖啡酸 綠原酸Cmax（ng/mL）729.43±24.561110.32±115.33 Tmax（min） 30.00±0.00 60.00±0.00 T1/2β（min） 180.42±25.54 115.94±16.12 AUC0-t（ng·min·mL-1） 155397.53±3059.14 191710.99±7263.26 AUC0-∞（ng·min·mL-1） 164351.80±3952.5731 195154.86±7437.44 MRT0-t（min） 213.67±3.35 194.24±4.84 MRT0-∞（min） 247.39±5.37 206.56±4.38 V/F/L 0.63±0.08 3.77±0.22

圖2 大鼠體內綠原酸和咖啡酸的平均血藥濃度-時間曲線（n=6）

4 討論

4.1 本文對血樣中酚酸類成分的提取方法進行了考察:甲醇沉淀、乙腈沉淀、乙酸乙酯提取、乙酸乙酯/乙醚（3∶1）提取，每個提取或沉淀條件考察了不同的酸化條件 （加不同量的 1mol/L鹽酸:10、20、30、50、100μL），結果發現50μL，1mol/L鹽酸酸化后乙酸乙酯的提取回收率高，無內源性物質干擾，重現性好。

4.2 在綠原酸和咖啡酸的測定及藥代動力學研究中，目前文獻多數使用HPLC和LC-MS/MS方法[8-12]，但分析時間多數在5～20min之間。本實驗建立大鼠血漿中咖啡酸、綠原酸的UPLC-MS/MS測定方法，并用于其在大鼠體內的藥代動力學研究，分析時間為2min。實驗表明所建立的方法迅速、準確、穩定、可靠。通過藥代動力學研究，獲得主要成分比較全面的藥代動力學參數，為臨床藥代動力學研究提供了參考。

[1] 王昃睿，王曉東，劉中華，等.清心解毒湯治療邪毒侵心型病毒性心肌炎.吉林中醫藥，2014，34（8）：789

[2] 皇甫海全，于海睿，張文釗，等.養心湯臨床應用研究進展.遼寧中醫藥大學學報，2014，16（7）：129

[3] 張秀華.病毒性心肌炎的臨床治療效果分析.中國醫藥指南，2014，12（18）：219

[4] Park W H，Kim S H，Kim C H.A new matrix metalloproteinase-9 inhibitor 3，4-dihydroxycinnamic acid（caffeic acid） from methanol extract of Euonymus alatus：isolation and structure determina-tion. Toxicology，2005，207（3）：383

[5] Jang D S，Yoo N H，Kim N H，et al.3，5-Di-O-caffeoyl-epiquinic acid from the leaves and stems of Erigeron annuus inhibits protein glycation，aldose reductase，and cataractogenesis.Biol Pharm Bull，2010，33（2）：329

[6] 張鞍靈，馬瓊，高錦明，等.綠原酸及其類似物與生物活性.中草藥，2001，32（2）：173

[7] 鄒小娟，劉志輝，錢芳.清熱養心顆粒的鑒別及其綠原酸含量測定.中國醫藥導報，2008，10（6）：908

[8] 李淼，王永香，孟謹，等.HPLC法測定金銀花中新綠原酸等8種成分的量.中草藥，2014，45（7）：1006

[9] 陳芳，鄧雁如，郭利平.HPLC法同時測定金銀花及金芪降糖片中9種成分的含量.天津中醫藥，2014，31（3）：168

[10] 謝麗艷，徐潔，戴國梁，等.HPLC同時測定消癌平注射液中7種主要成分的含量.中國實驗方劑學雜志，2013，19（21）：86

[11] 陳婷，唐躍年，胡燕鋒.HPLC法同時測定金銀花中4種主要成分的含量.中國藥師，2012，15（12）：1721

[12] 班麗娜，徐遠金.HPLC/MS同時測定雙黃連口服液中的4種有效成分.中成藥，2012，34（2）：265

編輯：吳 寧

R289.5

A

1672-397X（2015）05-0074-03

吳磊（1983—），男，碩士，主管中藥師，研究方向：中藥臨床藥代動力學。

居文政，主任中藥師，博士，博士生導師。wzhju333@163.com

2015-02-07