響應(yīng)曲面法優(yōu)化高純度油橄欖葉橄欖苦苷酶解工藝

原姣姣 ，王成章，2* ，葉建中，陳虹霞，張宇思，陶 冉，周 昊，2，劉玉紅

1中國林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所;生物質(zhì)化學(xué)利用國家工程實驗室;國家林業(yè)局 林產(chǎn)化學(xué)工程重點開放性實驗室;江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點實驗室，南京 210042;2 中國林業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)新技術(shù)研究所，北京 100091;3 隴南市翔宇油橄欖開發(fā)有限公司，隴南 746000

羥基酪醇(3，4-二羥基苯乙醇，Hydroxytyrosol，HT)，清除自由基的能力強，表現(xiàn)出獨特的生物活性［1-5］，如抗氧化、抗菌、抗炎、改善心臟的冠脈血流等。還能抑制人類早幼細(xì)胞白血病細(xì)胞HL60［6］、腺癌細(xì)胞HT29 及HT29 克隆體19A［7］、女性乳腺癌MCF-7 細(xì)胞［8］等擴散，透過阻滯腫瘤細(xì)胞的循環(huán)及誘發(fā)其凋亡，具有很好的抗癌活性。盡管羥基酪醇有諸多生物活性，但國際市場上還沒有批量生產(chǎn)天然羥基酪醇產(chǎn)品。天然羥基酪醇在橄欖葉中含量很低，僅有0.01%～0.8%［9］，大多數(shù)以酯化物(橄欖苦苷，Oleuropein，OE)的形式存在于油橄欖的各個部位。其中油橄欖果及葉中OE 含量高，尤其在葉中達到10%～17%［10］。目前HT 主要是從橄欖果、葉，以及在制備橄欖油或餐用橄欖果過程中產(chǎn)生的殘渣和廢水中分離的，而廢水中橄欖苦苷、女貞苷、毛蕊花苷等糖苷、黃酮苷及多酚類物質(zhì)成分復(fù)雜，分離效率低。現(xiàn)化學(xué)合成已有以酪醇［11］、3，4 -二羥基苯乙酸［12］、鄰苯二酚［13］、3，4-二羥基苯甲醛［14］等合成報道，但收率低，且原料和催化劑成本昂貴，反應(yīng)條件苛刻，無法工業(yè)化制備。采用生物轉(zhuǎn)化法合成羥基酪醇，大都以橄欖苦苷和酪醇進行酶降解［15-17］或者菌種(細(xì)菌［18-20］和真菌［21，22］)的轉(zhuǎn)化。此法反應(yīng)條件溫和，轉(zhuǎn)化率高，環(huán)境污染小，具有不可比擬的優(yōu)勢，已成為國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點。

Briante 等［16］利用固定化的嗜高溫β-葡萄糖苷酶(pH=7.0，60 ℃)降解OE(橄欖葉提取物)，并從復(fù)雜的酶解物中分離出91%～94%以上的HT，但該方法成本昂貴。卜文文等［23］還對鹽酸法和β-葡萄糖苷酶法水解橄欖葉提取物制備羥基酪醇的方法進行了結(jié)果比較，從生產(chǎn)成本角度認(rèn)為鹽酸法比酶法更適合，但酶法降解得到的羥基酪醇含量也很低，需要復(fù)雜的純化工藝來獲得高純度產(chǎn)品。

本實驗采用高純度(81.04%)的橄欖苦苷橄欖葉提取物，篩選各種酶以確定最佳酶解效果和價格適宜的降解酶系，使其后續(xù)分離純化工作以及探討酶解機理相對簡單。在單因素試驗(時間、pH、溫度、酶底物比)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法(response surface methodology，RSM)實驗設(shè)計，以測得的HT 含量為考核指標(biāo)，對pH、溫度、酶底物比的水平參數(shù)選擇進行優(yōu)化，進而確定最佳酶解工藝，對油橄欖葉有效制備HT 具有重要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

HT 對照品(純度≥98%)和OE 對照品(純度≥98%)，上海阿拉丁試劑公司。甲醇為市售色譜純試劑，磷酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等其余試劑均為市售分析純試劑。橄欖葉提取物(OE 含量為81.04%，HT 含量2%左右)，實驗室自制，密封放于干燥器內(nèi)備用。中溫淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、木瓜酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、β-葡聚糖酶、半纖維素酶、單寧酶、β-葡萄糖苷酶均購于蘇柯漢(濰坊)生物有限公司。

日本島津LC-20AT-DAD 高效液相系統(tǒng)，島津UV-1800 紫外可見分光光度計;ALE-200 梅特勒電子天平，ZWY-110X30 型水浴搖床，PHS-3C 型pH計，H1650 高速臺式離心機，HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，SHB-3 型循環(huán)水多用真空泵，KQ5200DE 數(shù)控超聲波清洗器，R-201D 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。

1.2 分析方法

液相條件為:色譜柱為C18ODS 色譜柱(250 ×5 mm，5 μm)，柱溫為30 ℃，甲醇∶水=35∶45(0.2%磷酸)為流動相，進樣量10 μL，紫外吸收波長為280 nm，流速為1 mL/min。

精確稱取HT 和OE 對照品5.7 mg 和4.5 mg一起置于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解搖勻，并定容，密塞，得到濃度為0.57 mg/mL 和0.45 mg/mL的對照品混合標(biāo)準(zhǔn)母液。分別精密吸取此標(biāo)準(zhǔn)品溶液1、2、4、6、8、10、12、14、16 μL，自動進樣，每個樣品重復(fù)進樣3 次，分別取HT 和OE 的HPLC 峰面積平均值。然后，以HPLC 峰面積為縱坐標(biāo)，HT 和OE質(zhì)量(μg)分別為橫坐標(biāo)，繪制HPLC 標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出方程。采用液相分析法對酶解條件下(60 ℃，pH=5，酶解6 h)同一樣品測定6 次，并計算測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，以評價該方法的精密度。

1.3 酶解方法

選取中溫淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、木瓜酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、β-葡聚糖酶、半纖維素酶、單寧酶、β-葡萄糖苷酶這10 種酶。稱取相同酶活力的各種酶，在各種酶的最適pH(磷酸緩沖溶液，0.1 mol/L，50 mL)和最適溫度下，分別對500 mg 油橄欖葉提取物酶解6 h。酶解結(jié)束后，90 ℃滅酶10 min，酶解液在5000 rpm 離心10 min，過濾，然后進行液相分析，得到OE 降解率和HT 含量。每次試驗進行3 次，求其平均值。OE 降解率=1-酶解液OE 含量/提取物OE 含量(81.04%);HT 含量=酶解液HT 含量/提取物質(zhì)量。

1.4 單因素試驗

取500 mg 油橄欖葉提取物樣品置于100 mL 錐形瓶，加入50 mL 緩沖溶液(磷酸緩沖溶液，0.1 mol/L)和一定量的半纖維素酶，在一定溫度下酶解。酶解結(jié)束后，90 ℃滅酶10 min，酶解液在5000 rpm 離心10 min，過濾，用HPLC 分析濾液中HT 和OE，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各含量。

以O(shè)E 降解率和HT 含量為檢測指標(biāo)，以油橄欖葉提取物為原料，對pH(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)、溫度(30、40、50、60、70、80 ℃)、時間(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h)、酶底物比(1∶100、1∶50、1∶33.33、1∶25、1∶20、1∶10、1∶6.67、1∶5、1∶4、1∶3.33、1∶2.86、1∶2.5)進行單因素探索試驗，研究不同因素對半纖維素酶水解OE 效率的影響。每次試驗進行3 次，求其平均值。

1.5 響應(yīng)面法中心組合設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，為了考察各因素交互作用對油橄欖葉提取物酶解效率的影響及其影響因素的主次，并得到最佳酶解條件，采用中心組合設(shè)計，以pH、酶解溫度、酶底物比這3 個獨立變量為考察因素，利用Design-Expert 7.0 軟件進行Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計，建立響應(yīng)值與影響因素間的數(shù)學(xué)模型。試驗設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面3 因素3 水平試驗設(shè)計Table 1 Factors and levels in response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

以液相圖譜峰面積為縱坐標(biāo)，OE 和HT 質(zhì)量為橫坐標(biāo)，分別得到各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，OE在0.441～7.056 μg 內(nèi)與其峰面積呈線性關(guān)系。并且在此范圍內(nèi)線性回歸方程為y=1772846.78x +89802.31，相關(guān)系數(shù)R2=0.9997。HT 在0.5586～8.9376 μg 內(nèi)與其峰面積呈線性關(guān)系，并且在此范圍內(nèi)線性回歸方程為y=1199063.90x+119947.13，相關(guān)系數(shù)R2=0.9996。

液相分析OE 和HT 含量方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.92%和1.38%，說明其分析方法精密度較高，重復(fù)性好。

2.2 酶種類的確定

從文獻［15］可知，OE 降解為HT 需斷裂糖苷鍵和酯鍵。酯的水解反應(yīng)在酸性或者堿性條件下都可以進行，不需要特定的酶來水解。本實驗主要針對糖苷鍵的斷裂來選擇有針對性、專一性的降解酶系。據(jù)作用機制得知，中溫淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、半纖維素酶［24］這6 種酶都會對糖苷鍵有一定的斷裂作用。同時考察木瓜酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、單寧酶是否對糖苷鍵的斷裂有很好的作用。

在相同酶活力的各種酶降解下，由圖1 中可看出半纖維素酶的OE 降解率(91.04±1.25%)和HT含量(9.84±0.11%)都較高，其次為纖維素酶(65.94±1.35%，6.92±0.09%)和β-葡萄糖苷酶(56.37±1.95%，7.94±0.12%)。中性蛋白酶對OE 有著一定的降解效果(73.33±1.56%)，但HT含量(3.61±0.15%)卻不高。木瓜酶(37.38±1.97%，4.24±0.12%)、單寧酶(20.85±1.82%，3.36±0.16%)、糖化酶(17.95±1.46%，3.11±0.17%)、β-葡聚糖酶(13.31±1.75%，2.93±0.12%)和中溫淀粉酶(22.59±1.56%，3.92±0.12%)對油橄欖葉高含量OE 的降解效果都不理想，且堿性蛋白酶(8.03±1.73%，2.84±0.15%)的降解效率最差。故選半纖維素酶作為最佳酶種研究OE 的降解工藝。

圖1 酶的種類對油橄欖葉提取物酶解效率的影響(n=3)Fig.1 Hydrolysis efficiency of different enzymes on olive leaf extracts (n=3)

圖2 pH(A)、溫度(B)、時間(C)及酶底物比(D)對油橄欖葉提取物酶解效率的影響(n=3)Fig.2 Effects of pH (A)，temperature (B)，time (C)and ratio of enzyme quantity and substrate (D)on enzyme hydrolysis efficiency of olive leaf extracts (n=3)

2.3 單因素實驗

2.3.1 pH 對油橄欖葉提取物酶解效率的影響

當(dāng)酶解溫度60 ℃，時間6 h，酶底物比為1∶10，不同pH(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)對酶解效率的結(jié)果見圖2(A)。OE 降解率和HT 含量都呈現(xiàn)出先增后減趨勢，在pH=5 時最高，OE 降解率和HT 含量分別為99.07±0.83%和10.32±0.12%。在pH 為4 和7 時結(jié)果都不佳，尤其是pH 為7，說明半纖維素酶的酶解反應(yīng)不適合偏堿性環(huán)境。所以選擇4.5、5、5.5 為考察實驗的水平參數(shù)。

2.3.2 酶解溫度對油橄欖葉提取物酶解效率的影響

當(dāng)pH5，時間6 h，酶底物比為1∶10，不同酶解溫度(30、40、50、60、70、80 ℃)對酶解效率的結(jié)果見圖2(B)。OE 降解率和HT 含量隨著溫度的增加呈現(xiàn)出增長趨勢，在50 ℃時達到最大值之后，隨著溫度的升高兩者都急劇下降，酶解效率顯著下降，且80 ℃時酶活性很低。這可能由于半纖維素酶在80℃以上失去酶活力所致。所以選用40、50、60 ℃為考察實驗的水平參數(shù)。

2.3.3 酶解時間對油橄欖葉提取物酶解效率的影響

當(dāng)pH5，溫度60 ℃，酶底物比為1∶10，不同時間(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h)對酶解效率的結(jié)果見圖2(C)。隨著時間增加，OE 含量顯著降低，HT 含量急劇增長。但在6 h 之后，OE 降解率反而降低了，而HT 含量還持續(xù)增長狀態(tài)。可能由于之前OE降解的中間產(chǎn)物還未能及時地生成HT，故隨著時間的延長其含量增加，但增長趨勢不顯著。HT 含量在4、5、6、7 h 變化不大，考慮到影響大小的原因，此因子不考慮為考察實驗的水平參數(shù)。

2.3.4 酶底物比對油橄欖葉提取物酶解效率的影響

當(dāng)pH5，溫度60 ℃，時間6 h，不同酶底物比(1∶100、1∶50、1∶33.33、1∶25、1∶20、1∶10、1∶6.67、1∶5、1∶4、1∶3.33、1∶2.86、1∶2.5)對酶解效率的結(jié)果見圖2(D)。OE 隨著酶量的增加其降解率增加，但酶底物比1∶10 之后的OE 降解率變化不大。HT 含量在酶底物比1∶10 時最高，在此之后隨著酶量的增加其含量降低。所以選1∶20、1∶10、1∶6.67 酶底物比作為實驗的考察水平參數(shù)。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件

2.4.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果

以HT 含量為響應(yīng)值(Y)，進行Box-Behnken 3因素3 水平的設(shè)計，試驗結(jié)果如表2 所示，方差分析 見表3、4。

表2 Box-Behnken 設(shè)計方案及響應(yīng)值Table 2 Box-Behnken experimental design and corresponding extraction yields

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of items in regression equation

從表3 可以看出，模型的F 值為14.98(P＜0.001)，表明方程達到極顯著，模型能夠用于真實實驗數(shù)據(jù)的預(yù)測;而模型的失擬項F 值為20.12(P＜0.05)，表明方程失擬顯著，固對此模型進行了手動優(yōu)化，結(jié)果見表4。模型的F 值為113.34(P＜0.001)，表明方程達到極顯著，模型能夠用于真實實驗數(shù)據(jù)的預(yù)測;模型的失擬項F 值為1.21(P＞0.05)，表明方程失擬不顯著，計算數(shù)值與實測數(shù)值能較好擬合。系數(shù)(R2=0.9960)和校正系數(shù)(=0.9872)也是模型很重要的參數(shù)，其結(jié)果顯示該模型有著很好的擬合關(guān)系。且信噪比(29.880)表明模型有著很好的信號。

在一次項中，X1pH 和X2溫度對油橄欖葉提取物酶解為HT 含量的影響達到顯著水平(P＜0.05)，在二次項中pH、溫度和酶底物比對油橄欖葉提取物酶解為HT 含量的影響均達到極顯著水平(P＜0.001);在交互項中，X1X2和X2X3發(fā)現(xiàn)對Y 值有顯著性影響。綜上所述，各因素對油橄欖葉提取物酶解過程的影響復(fù)雜，受多方面的影響，并非簡單的線性關(guān)系。

各項因素對酶解后HT 含量的影響經(jīng)回歸擬合后得到二次多項回歸模型為:

Y=11.16+0.20X1+0.39 X2+0.026X3+0.17X1X2+0.023X1X3+0.53X2X3–。式中，Y代表HT 含量(%);X1、X2and X3分別代表pH、溫度和酶底物比。根據(jù)回歸模型方程3 個因素前的擬合系數(shù)0.39＞0.20＞0.026 可知，3 個考察因素對酶解的影響大小為X2(溫度)＞X1(pH)＞X3(酶底物比)，pH 和溫度是酶解過程中主要因素。

表4 手動優(yōu)化的回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of items in regression equation by manual optimization

2.4.2 響應(yīng)曲面圖分析

由圖3 可見，3 個交互項中X1X2、X2X3存在較為顯著的交互作用，表現(xiàn)為響應(yīng)曲面的等高線圖呈橢圓狀，這說明:pH 與溫度這兩個因素存在相互影響，當(dāng)pH 值小時，即酸性相對強時，可將OE 降為HT，此時不需要很高溫度，反之，當(dāng)pH 值大時，即酸性相對弱時，較高溫度可以更好地降解OE;酶解溫度與酶底物比亦存在較為明顯的相互作用，這說明當(dāng)提取溫度較低時，加大酶的用量(酶底物比小)可有效提高HT 含量，而當(dāng)酶解溫度較高時，酶的活性也增加，同時為了防止酶活性過高繼而破壞酚類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，必須適當(dāng)減少酶的質(zhì)量(酶底物比大)。交互項X1X3的等高線形狀偏向于圓形，表明pH 與酶底物比這兩項的交互作用并不顯著，說明這兩者相互作用對酶解產(chǎn)物含量的影響較小。上述分析與模型回歸的方差分析基本一致。

圖3 各因素交互作用對HT 含量的影響Fig.3 Response surface plots and contour plots showing mutual effects of different factors on HT content

2.4.3 優(yōu)化與驗證實驗

通過上述回歸模型分析并計算得到半纖維素酶水解油橄欖葉提取物的最佳工藝條件為:油橄欖葉提取物(81.04% OE)500 mg，pH 5.06，溫度54.80℃，酶底物比為1∶9.1，時間6 h。考慮到實際實驗和生產(chǎn)的可操作性，將以上最優(yōu)參數(shù)分別調(diào)整為pH 5，溫度55 ℃，酶底物比為1∶9.1，并據(jù)此進行結(jié)果驗證。平行測定3 次所獲HT 含量為(11.31±0.15)%，OE 的降解率為98.54±1.63%。與模型預(yù)測值(11.28%)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.33%＜5%，說明經(jīng)該模型推測得到的最佳工藝參數(shù)對實際操作的預(yù)測較為可靠，有一定指導(dǎo)意義。

Briante 等［16］利用固定化的嗜高溫β-葡萄糖苷酶(pH=7.0，60 ℃)降解OE(橄欖葉提取物)，并從復(fù)雜的酶解物中分離出91%～94%以上的HT。此方法采用的橄欖葉提取物中OE 含量為37.7%，且可得到42.3 mg/100 mg 產(chǎn)物。說明嗜高溫β-葡萄糖苷酶對橄欖苦苷的降解效果很好，且固定化之后酶活更高。卜文文等［23］認(rèn)為橄欖葉中OE 水解為HT 的鹽酸法比酶解法效果好，且酸解后HT 含量為7.83%、酶解為3.91%。這可能由于此實驗使用常溫且酶活低的β-葡萄糖苷酶水解的緣故。相比之下，其酶解結(jié)果沒有本實驗結(jié)果高，但和本實驗2.2中常溫β-葡萄糖苷酶和半纖維素酶的酶解效果結(jié)果一致。本實驗選用的酶種β-葡萄糖苷酶是常溫的(37 ℃)，效果有但不是最好;其次本實驗使用的纖維素最適溫度為45 ℃，半纖維素的最適溫度為45～60 ℃，且纖維素和半纖維素中都還有β-葡萄糖苷酶系。所以由此可以看出，溫度對酶解OE 有著很大的決定作用，且本實驗所選酶種中半纖維酶的酶解效果最好。

3 結(jié)論

半纖維素酶對油橄欖葉提取物的OE 有著很好的降解作用，且對影響其酶解效果的pH、溫度、時間、酶底物比4 個因素分別進行了考察。在此基礎(chǔ)上對pH、溫度和酶底物比進行3 因素3 水平的Box-Behnken 響應(yīng)面分析，建立了以HT 含量為響應(yīng)值的數(shù)學(xué)模型:Y=11.16+0.20X1+0.39 X2+0.026X3+0.17X1X2+0.023X1X3+0.53X2X3–，模型回歸方程顯著，可用于實際預(yù)測。

通過響應(yīng)面法優(yōu)化半纖維素酶水解油橄欖葉提取物的最佳工藝條件為:油橄欖葉提取物(81.04%OE)500 mg，pH 5，溫度55 ℃，酶底物比為1∶9.1，時間6 h。在此酶解工藝下，HT 含量為為11.31%，OE降解率為98.54%。

1 Visioli F，Caruso D，Plasmati E，et al.Hydroxytyrosol，as a component of olive mill waste water，is dose-dependently absorbed and increases the antioxidant capacity of rat plasma.Free Radical Res，2001，34:301-305.

2 Bisignano G，Tomaino A，Cascio RL，et al.On the in-vitro antimicrobial activity of oleuropein and hydroxytyrosol.J Pharm Pharmacol，1999，51:971-974.

3 Killeen MJ，Pontoniere P，Crea R.Hydroxytyrosol:An examination of its potential role in cardiovascular disease，inflammation，and longevity.Agro Food Ind Hi Tech，2011，22(5):16-19.

4 Owen RW，Giacosa A，Hull WE，et al.The antioxidant/anticancer potential of phenolic compounds isolated from olive oil.Eu J Cancer，2000，36:1235-1247.

5 Liu WZ (劉威振)，Zhang Xi (張興)，Chen XJ (陳新建)，et al.Research progress on pharmacological actions of hydroxytyrosol.J Guangdong Pharm Univ (廣東藥學(xué)院學(xué)報)，2012，28:684-688.

6 Fabiani R，De Bartolomeo A，Rosignoli P，et al.Virgin olive oil phenols inhibit proliferation of human promyelocytic leukemia cells (HL60)by inducing apoptosis and differentiation.J Nutri，2006，136:614-619.

7 Bernini R，Crisante F，Merendino N，et al.Synthesis of a novel ester of hydroxytyrosol and α-lipoic acid exhibiting an antiproliferative effect on human colon cancer HT-29 cells.Eu J Med Chem，2011，46:439-446.

8 Bouallagui Z，Han J，Isoda H，et al.Hydroxytyrosol rich extract from olive leaves modulates cell cycle progression in MCF-7 human breast cancer cells.Food Chem Toxicol，2011，49:179-184.

9 Ye JZ (葉建中)，Wang CZ (王成章)，Chen HX (陳虹霞)，et al.Content determination and extraction technology of hydroxytyrosol from olive leaves.Chem Ind Forest Prod (林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè))，2011，31:63-67.

10 Wang CZ (王成章)，Gao CX (高彩霞)，Ye JZ (葉建中)，et al.Study on seasonal variation of oleuropein content in olive leaves by HPLC.Chem Ind Forest Prod (林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè))，2008，28(6):39-43.

11 Lucia MD，Panzella L，Pezzella A，et al.Oxidative chemistry of the natural antioxidant hydroxytyrosol:Hydrogen peroxidedependent hydroxylation and hydroxyquinone/o-quinone coupling pathways.Tetrahedron，2006，62:1273-1278.

12 Baraldi PG，Simoni D，Manfredini S，et al.Preparation of 3，4-dihydroxy-1-benzeneethanol:A reinvestigation.Liebigs Annalen der Chemie，1983，1983:684-686.

13 Xu C (許超)，Gao JC (高俊超)，Zhang J (張堅)，et al.Process research of hydroxytyrosol synthesis.Fine Chem (精細(xì)化工)，2012，27:1209-1212.

14 Zhang ZL，Chen JL，Xu QM，et al.Effcient synthesis of hydroxytyrosol from 3，4-dihydroxybenzaldehyde.Synthetic Commun，2012，42:794-798.

15 Briante R，Cara FL，Tonziello MP，et al.Antioxidant activity of the main bioactive derivatives from oleuropein hydrolysis by hyperthermophilic β-glycosidase.J Agric Food Chem，2001，49:3198-3203.

16 Briante R，Patumi M，F(xiàn)ebbraio F，et al.Production of highly purified hydroxytyrosol from Olea europaea leaf extract biotransformed by hyperthermophilic β-glycosidase.J Biotechnol，2004，111:67-77.

17 Espin JC，Solar-rivas C，Cantos E.Synthesis of the antioxidant hydroxytyrosol using tyrosinase as biocatalyst.J Agric Food Chem，2001，49:1187-1193.

18 Santos MM，Piccirillo C，Castro PML，et al.Bioconversion of oleuropein to hydroxytyrosol by lactic acid bacteria.World J Microbiol Biotechnol，2012，28:2435-2440.

19 Allouche N，Damak M，Ellouz R，et al.Use of whole cells of Pseudomonas aeruginosa for synthesis of the antioxidant hydroxytyrosol via conversion of tyrosol.Appl Environ Microbiol，2004，70:2105-2109.

20 Allouche N，Sayadi S.Synthesis of hydroxytyrosol，2-hydroxyphenylacetic acid，and 3-hydroxyphenylacetic acid by differential conversion of tyrosol isomers using Serratia marcescens Strain.J Agric Food Chem，2005，53:6525-6530.

21 Khoufi S，Hamza M，Sayadi S.Enzymatic hydrolysis of olive wastewater for hydroxytyrosol enrichment.Biores Technol，2011，102:9050-9058.

22 Halaouli S，Asther M，Kruus K，et al.Characterization of a new tyrosinase from Pycnoporus species with high potential for food technological applications.J Appl Microbiol，2005，98:332-343.

23 Bu WW (卜文文)，Liu CJ (劉常金)，Tian SF (田仕夫).Comparison of extraction of olive leaves to prepare hydroxytyrosol by hydrochloric acid and β-glycosidase.Sci Technol Food Ind (食品工業(yè)科技)，2011，32:228-232.

24 Xue ZF(薛戰(zhàn)峰)，Guo YR(郭玉蓉)，F(xiàn)u CC(付成程)，et al.Extration of dietary fiber from apple flesh pomace using hemicellulase.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2013，25:1474-1479.