曼氏無針烏賊墨汁黑色素對亞急性衰老模型小鼠抗氧化功能的影響

周月越，王力東，杜美鳳，王春琳，母昌考，李榮華，宋微微

寧波大學海洋學院 應用海洋生物技術教育部重點實驗室，寧波 315211

衰老是一種極其復雜的多因子過程，它具有普遍性、內生性、漸進性和危害性的特點。關于衰老的理論也是多種多樣，總體可以分為兩大類即“程序性”衰老理論和“錯誤性”衰老理論［1］。隨著世界人口加速老齡化，針對不同的衰老理論，各種抗衰老藥物的研究已經成為研究的熱點。由于D-半乳糖小鼠能引起許多類似衰老的改變如抗氧化酶活力及免疫能力的下降，1991年龔國清等首次用D-半乳糖構建了小鼠衰老模型，該模型現已經廣泛應用于各種抗衰老藥物的研究中［2］。

曼氏無針烏賊(Sepiella maindroni，Rochebrune)俗稱墨斗魚、海貓等，隸屬于軟體動物門、頭足綱、十腕目、烏賊科，是我國近海廣布性種，其墨汁是由直徑120～180 nm 的顆粒形成的黑色懸濁液，攝食或遇敵時噴出以麻醉捕食者及保護自身安全。曼氏無針烏賊墨汁中主要成分為黑色素，它是由兩種基本結構單元(5，6-二羥基吲哚和5，6-二羥基-2-吲哚羧酸)形成的多聚物。黑色素參加許多生理、病理活動，黑色素具有抗紫外輻射作用［3，4］，DNA 光保護作用，黑色素還具有抗脂質過氧化、清除超氧化物自由基、螯合金屬離子的能力［5］。最近的研究表明，泰和烏骨雞［6］、工程菌［5］、人體毛發［7］、茶葉［8］中的黑色素都具有抗氧化抗衰老的功能。曼氏無針烏賊墨汁為海產品加工過程中的廢棄物，它的墨汁約為總體重的1.28%，比例較大，且墨汁中黑色素純度很高，是開發保健黑色素產品的價廉質高的原料。而迄今為止關于曼氏無針烏賊墨汁黑色素(MSMI)在體內的抗氧化研究還未見報道。

本研究通過測定不同MSMI 處理組小鼠血清、肝臟、腦、心臟中的丙二醛(MDA)含量、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性，對MSMI 小鼠體內的抗氧化作用進行評價，為進一步開發墨汁黑色素提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物ICR 小鼠54 只，雌雄各半，體重(20±2)g，由寧波大學實驗動物中心提供(合格證:0023472)。

1.1.2 試劑與儀器

堿性蛋白酶(solarbio 公司);冰醋酸、D-半乳糖、無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司);抗壞血酸(Sigma 公司);丙二醛MDA 測定試劑盒，過氧化氫CAT 試劑盒，總超氧化物歧化酶T-SOD 測試盒，谷胱甘肽過氧化物酶GSH-Px 測試盒(南京建成生物工程研究所);FreeZone4.5 臺式冷凍干燥機(Labconco 公司);SPECTRA max190 酶標儀(Molecular Devices 公司);T-18Basic 內切式勻漿機購(IKA公司)。

1.1.3 MSMI 的制備

取曼氏無針烏賊墨囊300 只，擠壓沖洗墨囊獲得墨汁，三層紗布過濾防止破碎組織混入，8000 rpm離心10 min，去上清液，冷凍干燥，獲得黑色素粗品。用酶解法精制黑色素，用1.5%堿性蛋白酶在溫度為50 ℃，pH 為10.5 和底物濃度為2%的條件下酶解4 h 獲得高純度MSMI。

1.2 試驗方法

1.2.1 小鼠亞急性氧化衰老模型的建立和MSMI的灌胃

將54 只ICR 小鼠分成6 組，分別為空白對照組、衰老模型組、陽性對照組、MSMI 低劑量組、MSMI中劑組和MSMI 高劑量組。除空白對照組皮下注射生理鹽水外，其他5 組小鼠皮下注射120 mg/(kg·d)的D-半乳糖，建立小鼠亞急性氧化衰老模型。對低中高三組分別灌胃25 mg/(kg·d)、120 mg/(kg·d)、200 mg/(kg·d)的MSMI。陽性對照組灌胃120 mg/(kg·d)的維生素C，空白對照組灌胃等量生理鹽水。45 d 后頸椎脫臼處死，最后一次給藥后禁食不禁水12 h，稱完體重后，進行小鼠眼球取血，剝離脾臟、肝臟、心臟、腦，其中脾臟和肝臟稱濕重，血清4 ℃保存，其他所有樣品-80 ℃保存。

1.2.2 肝臟指數和脾臟指數的計算

1.2.3 生化指標的測定

將6 組小鼠的肝臟、腦、心臟取出，精確稱取其重量，按重量(g):體積(mL)為1∶9 的比例加入9 倍體積的生理鹽水，用內切式組織勻漿機坐冰勻漿后2500 rpm 離心10 min，取上清液即10%的組織勻漿備用。測定小鼠血清、肝臟、腦、心臟中丙二醛(MDA)含量，以及過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性，測定過程均按照試劑盒中的說明書進行操作。

1.3 統計學分析

所測得結果用平均值±標準差表示，采用SPSSV19.0 完成統計處理，組間差異性采用t 檢驗，以P＜0.05 為統計學顯著意義。

2 結果與分析

2.1 MSMI 對小鼠臟器指數的影響

45 d 處理后，6 組小鼠的臟器指數如表1 所示。與空白對照組相比，衰老模型組體重有顯著下降(P＜0.05)，肝臟指數，脾臟指數無明顯改變。與衰老模型組相比，Vc 組(P＜0.05)、MSMI 低劑量組(P＜0.01)、MSMI 中劑量組(P＜0.01)的體重都明顯上升，肝臟指數，脾臟指數無明顯改變。MSMI 高劑量組與衰老模型組相比體重明顯改變，肝臟指數明顯上升(P＜0.05)，脾臟指數無明顯改變。

2.2 MSMI 對小鼠血清中MDA 含量及CAT、SOD、GSH-Px 活性的影響

6 組小鼠血清中MDA 含量及CAT、SOD、GSH-Px 活性如表2 所示。與空白對照組相比，衰老模型組MDA 含量有顯著上升(P＜0.01)，CAT(P＜0.01)、SOD(P＜0.05)活力都明顯下降，GSH-Px 活力也有所下降，但并不顯著。陽性對照組即Vc 組與衰老模型組相比MDA 含量有顯著下降(P＜0.05)，CAT(P＜0.01)、GSH-Px(P＜0.05)活力都明顯提高，SOD 活力無顯著差異。MSMI 低劑量組與衰老模型組相比，MDA 含量有顯著下降(P＜0.01)，CAT(P＜0.01)、SOD(P＜0.01)活力顯著提高，GSH-Px 活力無顯著差異。與衰老模型組相比，MSMI 中劑量組(P＜0.01)、MSMI 高劑量組(P＜0.05)的MDA 的含量都顯著下降，CAT(P＜0.01)、SOD(P＜0.05)、GSH-Px(P＜0.01)的活力都明顯上升。

表1 MSMI 對小鼠臟器指數的影響(n=9，)Table 1 The effect of MSMI on organ indexes in mice (n=9，)

表1 MSMI 對小鼠臟器指數的影響(n=9，)Table 1 The effect of MSMI on organ indexes in mice (n=9，)

注:與正常對照組相比，# P＜0.05，##P＜0.01;與模型對照組相比，* P＜0.05，＊＊P＜0.01。Note:# P＜0.05，##P＜0.01 versus normal group;* P＜0.05，＊＊P＜0.01 versus the model group.

表2 MSMI 對小鼠血清中MDA 含量及CAT、SOD、GSH-Px 活性的影響Table 2 The effect of MSMI on MDA content and the activities of CAT，SOD，GSH-Px in mice serum

2.3 MSMI 對小鼠肝臟中MDA 含量及CAT、SOD、GSH-Px 活性的影響

6 組小鼠肝臟中MDA 含量及CAT、SOD、GSHPx 活性如表3 所示。衰老模型組與空白對照相比MDA 含量有顯著上升(P＜0.01)，Vc 組、低中高劑量MSMI 組與衰老模型組相比MDA 含量有顯著下降(P＜0.01)。衰老模型組與空白對照相比CAT活力有顯著下降(P＜0.01)，Vc 組、低中高劑量MSMI 組與衰老模型組相比CAT 活力有顯著上升(P＜0.05)。衰老模型組與正常組相比SOD 活力有顯著下降(P＜0.01)，Vc 組、低中高劑量黑色素組與MSMI 組相比SOD 活力有顯著上升(P＜0.01)。衰老模型組與正常組相比GSH-Px 活力顯著下降(P＜0.01)，Vc 組、低中高劑量MSMI 組與衰老模型組相比GSH-Px 活力有顯著上升(P＜0.01)。

2.4 MSMI 對小鼠腦中MDA 含量及CAT、SOD、GSH-Px 活性的影響

6 組小鼠腦中MDA 含量及CAT、SOD、GSH-Px活性如表4 所示。與空白對照組相比，衰老模型組MDA 含量有顯著上升(P＜0.01)，CAT、SOD、GSHPx 活力有顯著下降(P＜0.05)。Vc 組與衰老模型組相比MDA 含量有顯著下降(P＜0.05)，CAT(P＜0.01)、SOD(P＜0.05)活力明顯提高，GSH-Px 活力無顯著變化。與衰老模型組相比，MSMI 低劑量組MDA 含量無明顯改變，CAT(P＜0.01)、SOD(P＜0.05)、GSH-Px(P＜0.01)活力明顯提高。與衰老模型組相比，MSMI 中劑量組MDA 含量明顯下降(P＜0.05)，CAT、SOD、GSH-Px 活力明顯提高(P＜0.01)。與衰老模型組相比，MSMI 高劑量組MDA含量明顯下降(P＜0.05)，CAT(P＜0.05)、SOD(P＜0.01)、GSH-Px(P＜0.01)活力明顯提高。

表3 MSMI 對小鼠肝臟中MDA 含量及CAT、SOD、GSH-Px 活性的影響Table 3 The effect of MSMI on MDA content and the activities of CAT，SOD，GSH-Px in mice liver

表4 MSMI 對小鼠腦中MDA 含量 及CAT、SOD、GSH-Px 活性的影響Table 4 The effect of MSMI on MDA content and the activities of CAT，SOD，GSH-Px in mice brain

2.5 MSMI 對小鼠心臟中MDA 含量及CAT、SOD、GSH-Px 活性的影響

6 組小鼠心臟中MDA 含量及CAT、SOD、GSHPx 活性測定結果如表5 所示。與空白對照組相比，衰老模型組的MDA 含量有顯著上升(P＜0.05)，CAT(P＜0.01)、SOD(P＜0.01)、GSH-Px(P＜0.05)的活力明顯提高。Vc 組與衰老模型組相比MDA 含量有顯著下降(P＜0.05)，CAT(P＜0.05)、GSH-Px(P＜0.05)活力明顯上升，SOD 活力無明顯改變。與衰老模型組相比，MSMI 低劑量組的MDA含量顯著降低(P＜0.05)，GSH-Px 活力顯著提高(P＜0.05)，CAT、SOD 活力無顯著差異。MSMI 中劑量組與衰老模型組相比，MDA 含量顯著提高(P＜0.01)，CAT、GSH-Px 活力顯著提高(P＜0.05)，SOD 活力無顯著差異。與衰老模型組相比，MSMI高劑量組的MDA 含量顯著降低(P＜0.05)，CAT、SOD、GSH-Px 的活力無顯著改變。

表5 MSMI 對小鼠心臟中MDA 含量 及CAT、SOD、GSH-Px 活性的影響Table 5 The effect of MSMI on MDA content and the activities of CAT，SOD，GSH-Px in mice heart

注:與正常對照組相比，# P＜0.05，##P＜0.01;與模型對照組相比，* P＜0.05，＊＊P＜0.01Note:# P＜0.05，##P＜0.01 versus normal group;* P＜0.05，＊＊P＜0.01 versus the model group

3 討論

衰老是生命體隨著年齡增長而發生的組織、器官衰退的復雜多因子過程，它具有有、普遍性、內生性、漸進性、危害性的特點。衰老的機制很復雜，有關衰老的理論、學說或假設已不下200 種，如線粒體學說、自由基學說、糖基化衰老學說、端粒學說、中醫脾腎學說等［9］。1956年Harman 首次提出自由基衰老學說，該學說認為:機體正常代謝過程中會產生自由基和過氧化物會，它們攻擊正常的細胞、組織，從而導致機體衰老［10］，正常情況下機體可以通過各種抗氧化酶和各種抗氧化劑對這些損害進行防御:(1)各種抗氧化酶:過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等;(2)抗氧化劑:維生素C、維生素E、β-胡蘿卜素等［11］。機體衰老時，自由基的產生會增多，機體和組織的抗氧化酶活力下降，導致過多的自自由基堆積。這些多余的自由基會引發含醛基的脂質過氧化，該反應會產生代謝產物丙二醛MDA，丙二醛還可與氨基酸蛋白質等大分子發生交聯作用產生脂褐素，在腦、肝臟、皮膚等部位的細胞內大量堆積，通過測量MDA 含量可反應出組織的過氧化損傷程度。

在進行衰老研究時，通常需要造成接近臨床衰老癥狀的動物模型，由于D-半乳糖小鼠能引起許多類似衰老的改變如抗氧化酶活力及免疫能力的下降，1991年龔國清等首次用D-半乳糖構建了小鼠衰老模型，該模型現已經廣泛應用于各種抗衰老藥物的藥理學研究中［12，13］。D-半乳糖主要有3 種代謝途徑，D-半乳糖可經半乳糖激酶、1-磷酸-半乳糖轉尿苷酰酶、半乳糖尿苷-2-磷酸-4-異構酶的作用下形成1-磷酸葡萄糖，從而進入糖酵解途徑，此途徑為半乳糖體內代謝的主要途徑。另外，D-半乳糖在醛糖還原酶的作用下可以形成有細胞毒性的半乳糖醇。前兩條途徑都沒有產生自由基或過氧化物，半乳糖的第三條代謝途徑涉及一種重要的酶即半乳糖氧化酶，它能夠催化伯醇和O2反應產生醛類和H2O［14］2。Salganik 等通過電子順磁共振(EPR)波譜技術檢測到D-半乳糖衰老大鼠的肝臟中羥基自由基的水平顯著上升［15］，同樣張熙等發現在大鼠腦中自由基顯著增加［16］。這些都說明D-半乳糖致衰模型的原理可能是通過，至少部分通過自由基的增加從而加速衰老過程。

在本實驗中，D-半乳糖衰老模型組與正常組相比，小鼠血清、肝臟、腦、心臟中丙二醛(MDA)含量都顯著上升，過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性明顯下降，這些結果與以前研究所報道的一致［2，15］，說明小鼠D-半乳糖亞急性衰老模型建模成功。陽性對照組(即維生素C 組)與衰老模型組相比，小鼠血清、肝臟、腦、心臟中丙二醛(MDA)含量都顯著下降，過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性都有所上升，說明維生素C 具有明顯的抗氧化抗衰老功能，適合作為陽性對照。3 種不同劑量黑色素組與衰老模型組相比，小鼠血清、肝臟、腦、心臟中丙二醛(MDA)含量都顯著下降且和黑色素劑量成正比例，過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性都有所上升且和黑色素劑量成正比例，說明曼氏無針烏賊墨汁黑色素具有明顯的抗氧化抗衰老功能且黑色素劑量越大抗氧化效果越好，該研究為黑色素抗氧化作用的機制及保健食品、化妝品的開發提供理論依據。

1 Vina J，Borras C，Abdelaziz KM，et al.The free radical theory of aging revisited:the cell signaling disruption theory of aging.Antioxid Redox Signal，2013，19:779-787.

2 Ho SC，Liu JH，Wu RY.Establishment of the mimetic aging effect in mice caused by D-galactose.Biogerontology，2003，4:15-18.

3 Huang S，Pan Y，Gan D，et al.Antioxidant activities and UVprotective properties of melanin from the berry of Cinnamomum burmannii and Osmanthus fragrans.Med Chem Res，2011，20:475-481.

4 Brenner M，Hearing VJ.The protective role of melanin against UV damage in human skin.Photochem Photobiol，2008，84:539-549.

5 Ye M，Wang Y，Guo GY，et al.Physicochemical characteristics and antioxidant activity of arginine-modified melanin from Lachnum YM-346.Food Chem，2012，135:2490-2497.

6 Tu YG，Sun YZ，Tian YG，et al.Physicochemical characterisation and antioxidant activity of melanin from the muscles of Taihe Black-bone silky fowl (Gallus gallus domesticus Brisson).Food Chem，2009，114:1345-1350.

7 Herrling T，Jung K，Fuchs J.The role of melanin as protector against free radicals in skin and its role as free radical indicator in hair.Spectrochim Act A，2008，69:1429-1435.

8 Hung YC，Sava VM，Makan SY，et al.Antioxidant activity of melanins derived from tea:comparison between different oxidative states.Food Chem，2002，78:233-240.

9 Jang YC，Remmen HV.The mitochondrial theory of aging:Insight from transgenic and knockout mouse models.Exp Gerontol，2009，44:256-260.

10 Harman D.Aging:a theory based on free radical and radiation chemistry.J Gerontol，1956，11:298-300.

11 Beckman KB.The free radical theory of aging matures.Phys-iol Rev，1998，78:547-581.

12 Zhang XL，Jiang B，Li ZB，et al.Catalpol ameliorates cognition deficits and attenuates oxidative damage in the brain of senescent mice induced by d-galactose.Pharmacol Biochem Be，2007，88:64-72.

13 Zhang ZF，Fan SH，Zheng YL，et al.Purple sweet potato color attenuates oxidative stress and inflammatory response induced by d-galactose in mouse liver.Food Chem Toxicol，2009，47:496-501.

14 Bosch A.Classical galactosaemia revisited.J Inherit Metab Dis，2006，29:516-525.

15 Salganik RI，Solovyova NA，Dikalov SI，et al.Inherited enhancement of hydroxyl radical generation and lipid peroxidation in the S strain rats results in DNA rearrangements，degenerative diseases，and premature aging.Biochem Biophys Res Commun，1994，199:726-733.

16 Zhang X(張熙)，Li WB(李文彬)，Zhang BL(張炳烈).Biochemical changes of therat model of aging by inject D-galactose.Chin J Pharm Toxicol (中國藥理學與毒理學雜志)，1990，4:309-310.