7-脫甲氧基娃兒藤堿對小菜蛾的胃毒活性及作用機理初探

齊強強，楊敏麗，郭宏霞

上海師范大學生命與環境科學學院，上海 200234

7-脫甲氧基娃兒藤堿(7-Demethoxytylophorine)是從蘿藦科植物牛心樸子(Cynanchum komarovii)中分離出來的一種重要生物堿［1］。研究表明，這種生物堿對活體植株煙草花葉病毒TMV 和活體植株馬鈴薯Y 病毒有很高的抑制活性;對小麥赤霉病菌Gibberella zeae、番茄早疫病菌Altemaria solani、花生褐斑病菌Cercospora arachidicola 等植物病菌也有很好的殺菌活性［2］;還能抑制蝴蝶乳草花Asclepias tuberose、敘利亞馬利筋Asclepis syriaca 和大麻Cannabis sativa 等根系的生長［3］。此外，7-脫甲氧基娃兒藤堿還具有很好的抗癌活性，對白血病細胞P-338、人肝癌細胞Hep G2、人結腸癌細胞HCT116 和HT-29 和乳腺癌細胞MDA-MB-231 等均表現很好的細胞毒活性［4，5］。

本課題組在研究牛心樸子的殺蟲活性時發現其生物堿對小菜蛾(Plutella xylostella L.)有很好的毒殺作用［6］，采用活性跟蹤的方法從其總生物堿中分離得到7-脫甲氧基娃兒藤堿，初步活性測試表明該堿對小菜蛾有較好的活性［7］。本文以小菜蛾為試蟲，采用葉碟添加法測試了7-脫甲氧基娃兒藤堿對小菜蛾的胃毒活性，并結合電子顯微鏡技術和生化測試技術研究了它對小菜蛾中腸組織和消化酶活性的影響，研究結果表明7-脫甲氧基娃兒藤堿對小菜蛾幼蟲有較好的胃毒活性，其活性與對中腸上皮組織的破壞和消化酶的抑制有關。研究結果為更好地開發和利用7-脫甲氧基娃兒藤堿在殺蟲方面的作用及新農藥研究開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試藥液和試劑

7-脫甲氧基娃兒藤堿由本課題組從鵝絨藤屬植物牛心樸子中分離得到［7］，高效液相色譜法(Agilent 1100)測試其純度為95.5%。準確稱取一定量7-脫甲氧基娃兒藤堿，用50%丙酮溶解并定容，配制成一定濃度的溶液，測試時根據需要稀釋成相應的濃度，作為供試藥液。

Carnoy 固定液(自制):60 mL 無水乙醇+30 mL氯仿+10 mL 冰醋酸。試驗所用試劑均為分析純。

1.1.2 供試昆蟲

小菜蛾:由本實驗室人工繼代飼養，飼養環境:溫度23～26 ℃，濕度60%～70%，光照L∶D=14 h∶10 h。試驗時挑選健康、蟲體大小均一的3 齡幼蟲。

1.2 實驗儀器

HP400GS 人工氣候箱(武漢瑞華儀器設備有限責任公司)，L/L-S 電子天平(0.0001g，梅特勒-托利多儀器公司)，Leica RM2255 型石蠟切片機(德國Leica 公司)，Leica 雙目顯微鏡(德國Leica 公司)，LY-MN-HPDCCD 萬能視頻成像裝置(成都勵揚精密機電有限公司)，Neofuge 23R 臺式冷凍離心機(力康發展有限公司)，UV2450 紫外-可見分光光度儀(日本島津公司)，HH-6 型數顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)。

1.3 胃毒活性測試方法

將供試藥液用50% 丙酮依次稀釋成8.00、4.00、2.00、1.00、0.500 mg/mL，采用葉蝶添加法［8］測試其胃毒活性:用圓形打孔器(φ=1.5 cm)將新鮮甘藍葉打成葉碟，放入供試藥液中浸漬5 s(對照葉碟以50%丙酮作相同處理)，取出晾干放入培養皿中(內墊濾紙，用棉花球吸蒸餾水保濕)。每皿十字交叉放入4 片處理葉碟，接入10 頭饑餓6 h 的3齡小菜蛾幼蟲，每組重復3 次。48 h 后換成新鮮葉蝶，72 h 后開始記錄試蟲死亡情況和化蛹情況，連續觀察7 d。

死亡標準:蟲體變黑，成不規則的“1”或“V”字型，毛筆觸之不動。

按照公式(1)、(2)、(3)計算死亡率、校正死亡率和化蛹率，藥劑濃度轉化為對數，校正死亡率轉化為死亡幾率，以死亡幾率對藥劑濃度對數做回歸分析，得毒力回歸方程，計算致死中濃度(LC50)。

1.4 組織病理學觀察

用2.0 mg/mL 7-脫甲氧基娃兒藤堿藥液處理試蟲，72 h 后分別選中毒試蟲、死亡試蟲和50%丙酮處理的對照試蟲各30 頭投入60 ℃水中，蟲體伸直后剪除頭部，投入Carnoy 固定液。按常規石蠟切片法制成病理組織切片，HE 染色［9］。

1.5 小菜蛾體內消化酶活性的測試

1.5.1 酶液提取

分別挑選用2.0 mg/mL 藥液處理24、48 h 的試蟲及50%丙酮對照處理試蟲各25 頭，按照蟲體質量與甘油體積1∶10(g∶mL)的比例加入預冷的20%甘油，勻漿后于4 ℃，10000 r/min 離心20 min，取上清液做酶源［10］。20%甘油定容成25 mL，0 ℃冰箱中保存，12 h 內測定。

1.5.2 消化酶活力的測定

淀粉酶活力測定采用3，5-二硝基水楊酸法［11］，用麥芽糖制作標準曲線，緩沖溶液用pH 7.5 磷酸緩沖溶液，以30 ℃、20 min 內每分鐘單位質量的淀粉酶水解淀粉生成麥芽糖的量作為淀粉酶活力單位:mg/mg pro/min。

蛋白酶活力測定采用福林-酚法［12］，Folin-甲液為0.20 mol/L Na2CO3，pH 8.0 的磷酸緩沖溶液，用酪氨酸制作標準曲線。以30 ℃、15 min 內每分鐘單位質量的蛋白酶水解酪蛋白生成酪氨酸的量作為蛋白酶活力單位:mg/mg pro/min。

脂肪酶活力測定采用橄欖油乳劑比濁法［13］，用橄欖油乳劑制作標準曲線，緩沖溶液用pH 8.8 的Tris-HCl 溶液。以30 ℃、20 min 內每分鐘單位質量脂肪酶水解橄欖油生成甘油三酯的物質的量為脂肪酶活力:m mol/mg pro/min。

按公式(4)、(5)分別計算酶活性和酶活性抑制率

1.6 數據處理與分析

用Excel 2003 和DPS(7.05)專業統計軟件進行系統分組分析，用Duncan’s 新復極差法檢驗差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 7-脫甲氧基娃兒藤堿對小菜蛾的胃毒活性

使用葉碟添加法測試了7-脫甲氧基娃兒藤堿對小菜蛾的胃毒活性，結果見表1。分析結果可知，7-脫甲氧基娃兒藤堿對小菜蛾有較好的胃毒活性，隨著藥液濃度的增大和處理時間的延長，試蟲死亡率不斷增大，化蛹率不斷減小，8.00 mg/mL 藥液處理7 d 的死亡率為76.67%，化蛹率僅為10.00%，LC50為2.60 mg/mL。處理后存活的幼蟲在測試時間內不能正常生長，或者一直處在幼蟲期，處理24 h后的小菜蛾幼蟲出現取食減緩，爬動減緩，部分試蟲出現中毒癥狀:停止取食、身體發軟;隨時間延長，蟲體應激性降低，并出現水腫、繼而破裂，身體失水皺縮等死亡癥狀。

表1 7-脫甲氧基娃兒藤堿對小菜蛾的胃毒活性Table 1 Stomach toxicity of 7-demethoxytylophorine against 3th instar larvae of P.xylostella

2.2 7-脫甲氧基娃兒藤堿對小菜蛾中腸組織的影響

用雙目顯微鏡觀察小菜蛾組織病理切片。圖1中A、B、C 部分分別為中毒試蟲、對照試蟲及死亡試蟲的組織切片圖。從圖1(B)可以看出，對照處理的小菜蛾的腸壁上皮細胞排列整齊，杯狀細胞和柱狀細胞錯落有致，微桿和杯腔基部微絨毛清晰，圍食膜完整，腸腔內食物積累甚少。從圖1(A)可知，中毒試蟲食物積累較多，中腸壁彎曲、腸壁細胞排列疏松，微桿呈消融狀態，杯腔內充塞，杯腔基部微絨毛消失，圍食膜破壞，但上皮細胞未見明顯破壞;從圖1(C)可知，死亡試蟲腸壁細胞排列凌亂，圍食膜完全破壞。上皮細胞明顯破壞。分析圖1 可知，7-脫甲氧基娃兒藤堿對小菜蛾的中腸組織上皮細胞有明顯作用。中毒初期先作用于圍食膜，深度中毒試蟲的圍食膜被破壞失去保護上皮細胞的功能，造成中腸上皮細胞被破壞而致死。

2.3 7-脫甲氧基娃兒藤堿對小菜蛾消化酶活力的影響

按照以上方法分別測試了中毒試蟲和對照試蟲體內淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶的活性，結果如表2。

2.00mg/mL 7-脫甲氧基娃兒藤堿處理組及對照組淀粉酶活力差異顯著(F3，8=175.96，P＜0.0001)。處理24 h 淀粉酶活力與對照無差異;處理48 h 淀粉酶活力明顯下降，抑制率達到71.8%，與處理后24 h 相比，處理48 h 酶活力下降了26.0%。

2.00mg/mL 7-脫甲氧基娃兒藤堿處理組及對照組蛋白酶活力差異顯著(F3，8=2379.92，P＜0.0001)。處理后24 h 對蛋白酶活力抑制率為87.1%;處理48 h 抑制率為93.4%。與處理后24 h相比，處理48 h 蛋白酶活力下降了66.8%。

圖1 7-脫甲氧基娃兒藤堿對小菜蛾中腸的影響Fig.1 Effects of 7-demethoxytylophorine on midgut tissues of 3th instar larvae of P.xylostella

2.00mg/mL 7-脫甲氧基娃兒藤堿處理組及對照組脂肪酶活力差異顯著(F3，8=2042.23，P＜0.0001)。處理24 h 后對脂肪酶活力的抑制率為67.0%;處理48 h 后抑制率為89.2%，與處理后24 h 相比，處理48 h 脂肪酶活力下降了53.2%。

表2 7-脫甲氧基娃兒藤堿對小菜蛾消化酶活力的影響Table 2 Effect of 7-demethoxytylophorine on the activity of digestive enzymes of 3th instar larvae of P.xylostella

3 結論

7-脫甲氧基娃兒藤堿對小菜蛾有較好的胃毒活性，但活性作用較慢，活性隨藥液濃度的增加和處理時間延長而增強。藥液濃度為8.00 mg/mL 時，處理7 d 的死亡率為76.67%，相應的LC50為2.60 mg/mL。中毒后的小菜蛾應激性很低，生長速度明顯減緩，化蛹率也明顯降低，僅為10% (對照為93%)。死亡試蟲蟲體水腫、變黑，體型呈不規則的“V”字或者“1”字型。

7-脫甲氧基娃兒藤堿對小菜蛾的胃毒活性可能與其對小菜蛾消化系統的破壞和酶的抑制有關。7-脫甲氧基娃兒藤堿處理后的小菜蛾幼蟲中腸杯狀細胞受損，圍食膜不同程度被破壞，試蟲死亡可能與中腸上皮細胞破壞有關。同時，中毒試蟲的淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶的活性均受到不同程度的抑制，但低濃度的藥液對處理初期小菜蛾的取食活動影響較小，這與實驗切片中觀察到的腸內食物滯留使得中腸與對照相比變粗的情況一致，處理24 h 后小菜蛾取食減緩應與消化酶活性降低有關。藥劑對昆蟲消化系統的破壞，必將導致昆蟲營養不良，生長發育受阻乃至死亡。

1 Fang SD (方圣鼎)，Zhang R(張瑞)，Chen Y(陳燕)，et al.The chemical constituents from Cynanchum komarovii AL.iljinski.Acta Botan Sin (植物學報)，1989，31:934-938.

2 Wang QM(汪清民)，Yao YC(姚宇澄)，Huang RQ(黃潤秋)，et al.Antiviral activity of antofine from Cynanchum komarovii.Agrochemicals (農藥)，2007，6:425-427.

3 Gibson DM，Krasnoff SB，Biazzo J，et al.Phytotoxicity of antofine from Invasive Swallow-Worts.J Chem Ecol，2011，37:871-879.

4 Gao W，Chen AP，Leung CH，et al.Structural analogs of tylophora alkaloids may not be functional analogs.Bioorgan Med Chem Lett，2008，18:704-709.

5 Min HY，Chung HJ，Kim EH，et al.Inhibition of cell growth and potentiation of tumor necrosis factor-a (TNF-a)-induced apoptosis by a phenanthroindolizidine alkaloid antofine in human colon cancer cells.Biochem Pharmacol，2010，80:1356-1364.

6 Yan GJ(剡根姣)，Yang ML(楊敏麗)，Li JT(李建濤).Investigate on the common-toxicity of Cynanchum komarovii-Sophora alopecuroides mixtures against Diamondback Moth.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2012，24:969-971.

7 Guo H，Yang M，Qi Q.Insecticidal and antifeedant effects of two alkaloids from Cynanchum komarovii against larvae of Plutella xylostella L.J Appl Entomol，2014，138:133-140.

8 Li JB(李進步)，Fang LP(方麗平)，Xue JP(薛建平)，et al.The bioactivity of ethanol extracts of Pinellia ternate against Plutella xylostella.Chin Agric Sci Bull (中國農學通報)，2009，25:223-227.

9 Xiong ZY(熊正燕)，Zhou Q(周瓊)，Yu DC(余定椿).Technique of paraffin slices of insect intestine.Insect Research in Central China，Vol.Ⅵ(華中昆蟲研究，第6 卷).Changsha:Central South University Press，2010.95-98.

10 Zhou L(周琳)，Ma ZQ(馬志卿)，Feng JT(馮俊濤)，et al.Effects of the total alkaloid from Tripterygium wilfordii Hook on ultrastructure of the midgut cells and the digestive enzyme activities of Mythimna separata (Walker)larvae.J Henan Agric Univ (河南農業大學學報)，2009，43:418-421.

11 Podoler H，Applebaum SW.The (-amylase of the beetle Callosobruchus chinensis properties.Biochem J，1971，121:321-325.

12 Singleton VL，Rossi JA.Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents.Am J Enol Viticul，1965，16:144-158.

13 Zhang X(張興)，Zhao SH(趙善歡).Effects of activity of several Pieris rapae L.enzymes by Toosendanin.Acta Entomol Sin(昆蟲學報)，1992，35:171-177.