響應(yīng)面法優(yōu)化馬蘭總?cè)铺崛」に囇芯?/h1>
2015-01-09 05:07:28王國(guó)凱蔡百祥高衛(wèi)娜劉勁松
天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā) 2015年9期
王國(guó)凱，王 諍，蔡百祥，高衛(wèi)娜，劉勁松，王 剛
安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 現(xiàn)代中藥安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230012
馬蘭［Kalimeris indica (L.)Sch.-Bip］為菊科馬蘭屬植物［1］，具有涼血、清熱、利濕、解毒等功效［2］。臨床使用馬蘭治療乙肝的臨床多有報(bào)道，且療效顯著［3，4］。三萜類(lèi)化合物是廣泛存在于中藥中的一類(lèi)化合物，多數(shù)三萜由30 個(gè)碳原子組成。研究表明三萜類(lèi)化合物具廣泛的生物活性，具有較強(qiáng)的抗炎、抗菌、抗腫瘤等生物活性［5］，在前期研究的基礎(chǔ)上［6］，本實(shí)驗(yàn)旨在運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)選馬蘭最佳提取工藝，繼而最大限度提取馬蘭總?cè)疲ＷC能充分利用馬蘭藥材資源，提高經(jīng)濟(jì)效益，為研究開(kāi)發(fā)馬蘭提供科學(xué)依據(jù)。
1 材料與儀器
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
馬蘭全草2013年購(gòu)自安徽亳州藥材市場(chǎng)，標(biāo)本經(jīng)中藥標(biāo)本中心楊青山老師鑒定為菊科馬蘭屬植物馬蘭;齊墩果酸(批號(hào):110709 -201311)購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司;其它試劑均為分析純。
1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
UV757CRT 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(島津);AG-285 型十萬(wàn)分之一電子天平(賽多利斯);DZF-6050型真空干燥箱(上海博迅)。
2 實(shí)驗(yàn)方法
2.1 對(duì)照品溶液的制備
精密稱(chēng)取齊墩果酸對(duì)照品10.07 mg，用90%乙醇定容至50 mL，制成0.2014 mg/mL 的溶液作為對(duì)照品溶液。
2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制
分別吸取對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，置于試管中，水浴蒸干，分別加入新配制的5 %香草醛-冰醋酸0.2 mL 和高氯酸1.2 mL，搖勻后，置于70 ℃水浴加熱15 min，冷卻至室溫，加乙酸乙酯3.6 mL，隨行試劑做空白，波長(zhǎng)550 nm 處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。回歸方程y=48.619x-0.0742(r=0.9983)。
2.3 供試品溶液的制備及含量測(cè)定
精確稱(chēng)取馬蘭提取物0.1 g，用90%乙醇定容至50 mL 容量瓶中超聲至完全溶解。取2 mL 溶液，用90%乙醇定容至10 mL 容量瓶，搖勻。取供試品溶液1 mL 于試管中，85 ℃水浴蒸干，加入新配制的5%香草醛冰醋酸(5g 香草醛用冰醋酸溶解后，定容至100 mL)0.2 mL，高氯酸1.2 mL，放至70 ℃水浴中加熱15 min。取出流水冷卻至室溫，加乙酸乙酯3.6 mL，隨行試驗(yàn)做空白［7，8］。用紫外分光光度計(jì)波長(zhǎng)550 nm 處測(cè)定，代入回歸方程供試品中馬蘭總?cè)频暮俊?/p>
2.4 單因素試驗(yàn)
2.4.1 乙醇濃度考察
稱(chēng)取藥材50 g 各五份，以提取時(shí)間為1.5 h，提取次數(shù)為3 次，料液比為1∶15 g/mL，乙醇濃度分別以40%、50%、60%、70%、80%回流提取。
2.4.2 料液比考察
稱(chēng)取藥材50 g 各五份，以提取時(shí)間為1.5 h，提取次數(shù)為3 次，料液比分別以1 ∶9、1 ∶12、1 ∶15、1∶18、1∶21 g/mL 50%乙醇回流提取。
2.4.3 提取時(shí)間考察
稱(chēng)取藥材50 g 各五份，料液比為1 ∶15 g/mL 90%乙醇，提取次數(shù)為3 次，提取時(shí)間分別以0.5、1、1.5、2、2.5 h 進(jìn)行回流提取。
2.4.4 提取次數(shù)考察
稱(chēng)取藥材50 g 各五份，料液比為1 ∶15 g/mL 90%乙醇，提取時(shí)間為1.5 h，提取次數(shù)分別以1、2、3、4、5 次進(jìn)行回流提取。
2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化馬蘭總?cè)频奶崛」に?/h3>
在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理［9，10］，選出影響馬蘭總?cè)迫÷实乃膫€(gè)主要因素:乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)、提取次數(shù)(D)，進(jìn)行這四個(gè)因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，考察目標(biāo)為總?cè)铺崛÷省２捎肈esign-Expert 8.0.5b 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。
表1 響應(yīng)面分析因素及水平Table 1 Factors and levers of RSM analysis
圖1 乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)及提取次數(shù)(D)對(duì)馬蘭總?cè)频挠绊慒ig.1 Effects of ethanol concentration (A)，solid/liquid ratio (B)，ultrasonic duration (C)and times of extraction (D)on the yield of total triterpenes
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果
單因素試驗(yàn)考察結(jié)果可知50%乙醇、1∶15 g/mL、提取1.5 h、提取3 次提取最佳。
3.2 響應(yīng)面結(jié)果
以乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)、提取次數(shù)(D)為自變量，以得率(Y)為響應(yīng)值，用Design-Expert 8.0.5b 軟件進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
表2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The result of response surface design
對(duì)以上中心組合數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，可得到二次響應(yīng)面的回歸方程為:Y=+0.024-1.541E-003 ×A +3.869E-004 ×B+2.938E-004 ×C+2.493E-003 ×D-3.825E-004 ×AB +1.087E-003 ×AC-1.366E-003 ×AD-1.892E-004 ×BC-1.821E-004 × BD-1.395E-003×CD-2.454E-004 ×A2-2.501E-004 ×B2 +2.577E-004 ×C2-2.527E-003 ×D2
由回歸方程可知，對(duì)馬蘭總?cè)铺崛÷实挠绊懘笮№樞驗(yàn)?提取次數(shù)＞乙醇濃度＞料液比＞提取時(shí)間。對(duì)該方程進(jìn)行回歸分析。
表3 回歸分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for the developed polynomial model
結(jié)果表明A、B、C、D、AB、AC、AD、CD、A2、B2、C2、D2因素對(duì)馬蘭總?cè)频奶崛÷视绊戯@著，表明四個(gè)因素均有顯著的影響;其中AB、AC、CD 顯著表明在提取過(guò)程中乙醇濃度和料液比，乙醇濃度和提取時(shí)間，提取時(shí)間和提取次數(shù)的交互作用也會(huì)對(duì)馬蘭總?cè)铺崛÷蕩?lái)顯著影響。進(jìn)一步分析方程方差可知，由總模型P＜0.001 可知本實(shí)驗(yàn)所選取的二次多項(xiàng)式模型具有高度的顯著性;失擬項(xiàng)為0.8812＞0.05，故失擬項(xiàng)不顯著;決定系數(shù)R2=0.9959，校正決定系數(shù)R2Adj=0.9919，結(jié)果說(shuō)明模型可以解釋響應(yīng)值的變化，說(shuō)明擬合度較好，可以采用此模型對(duì)馬蘭總?cè)频奶崛」に囘M(jìn)行優(yōu)化。
3.3 響應(yīng)面圖與等高線(xiàn)圖分析
圖2A～D 是根據(jù)多元回歸方程得到的四個(gè)因素對(duì)馬蘭總?cè)铺崛÷视绊懙捻憫?yīng)面圖及等高線(xiàn)圖。圖2A 顯示了乙醇濃度與料液比對(duì)馬蘭總?cè)频寐实慕换プ饔茫蓤D可知，等高線(xiàn)呈橢圓形，說(shuō)明乙醇濃度和料液比之間的交互作用顯著。圖2B 顯示了乙醇濃度與提取時(shí)間對(duì)馬蘭總?cè)频寐实慕换プ饔茫蓤D可知，等高線(xiàn)呈橢圓形，說(shuō)明乙醇濃度與提時(shí)間之間的交互作用顯著。圖2C 顯示了乙醇濃度與提次數(shù)對(duì)馬蘭總?cè)频寐实慕换プ饔茫蓤D可知，等高線(xiàn)呈橢圓形，說(shuō)明乙醇濃度與提次數(shù)之間的交互作用顯著。圖2D 顯示了提取時(shí)間與提次數(shù)對(duì)馬蘭總?cè)频寐实慕换プ饔茫蓤D可知，等高線(xiàn)呈橢圓形，說(shuō)明提取時(shí)間與提次數(shù)之間的交互作用顯著。
3.4 驗(yàn)證性試驗(yàn)
圖2 各交互作用對(duì)馬蘭總?cè)朴绊懙捻憫?yīng)曲面Fig.2 Response surface plots showing the interactive effects of different factors on the yield of total triterpenes
通過(guò)數(shù)據(jù)分析，可得到馬蘭總?cè)铺崛〉淖罴压に嚍?乙醇濃度40%;料液比1∶18 g/mL;提取時(shí)間1 h;提取次數(shù)3.98 次。在此條件下，馬蘭總?cè)铺崛÷实睦碚撝禐?.83758%。綜上考慮:提取次數(shù)為4 次。驗(yàn)證性試驗(yàn)在此條件下平行提取3 次，測(cè)得實(shí)際提取率均值為2.68%。
4 結(jié)論
本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)運(yùn)用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)優(yōu)化馬蘭總?cè)频淖罴烟崛」に嚍橐掖紳舛?0%，料液比1∶18 g/mL，提取次數(shù)4 次，提取時(shí)間1 h。經(jīng)最佳工藝得到的馬蘭總?cè)频暮繛?6.83 mg/g。
1 Chinese Herbal Editorial Board，State Administration of Traditional Chinese Medicine，China.Chinese Herbal (國(guó)家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會(huì)).Shanghai:Shanghai Science and Technology Press，2006.7，886-889.
2 Editorial Office of National Chinese Herbal Medicine Collection.Collection of National Chinese Herbal Medicine (全國(guó)中草藥匯編).Beijing:People's Medical Publishing House，1975.
3 Zhou HH (周海虹).Clinical application of TCM Kalimeris indica.J Sichuan TCM (四川中醫(yī))，2003，21:23-24.
4 Zhou HH (周海虹).Application of Kalimeris indica treatingliver disease.Zhejiang J TCM (浙江中醫(yī)雜志)，1994.5:233.
5 Meng LL (蒙麗麗)，Huang CS (黃初升)，Liu HX (劉紅星).Advances in reseach on natural triterpenoids with bioactivities.Guihaia (廣西植物)，2008，28:856-860.
6 Ji P (季鵬)，Wang GK (王國(guó)凱)，Liu JS (劉勁松)，et al.Five Phenols from Kalimeris indica.Nat Prod Res Dev (天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā))，2014，26:212-214.
7 Ge F (葛飛)，Shi BJ (石貝杰)，Gong Q (龔倩)，et al.Optimal microwave extraction conditions of total triterpenoids from Volvariella volvacea mycelia by response surface methodology.Sci Tech Food Ind (食品工業(yè)科技)，2015，36:270-274.
8 Zhang HL (張華麗)，Zhu J (朱軍)，Gao GH (高桂花)，etal.Optimum extraction technology of total triterpenoids from Hypodematium sinense.J Chin Med Mater (中藥材)，2012，35:648-650.
9 Lu Y (陸洋)，Peng F (彭飛)，Huang LX (黃麗霞)，et al.Optimization of ultrasonic-assisted extraction conditions of polyphenol from Cyrtomium fortunei by response surface methodology.Nat Prod Res Dev (天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā))，2015，27:103-108.
10 Xu W (徐偉)，Ling WJ (凌偉堅(jiān))，Chu KD (褚克丹)，et al.Optimization of supercritical CO2extraction of Plantaginis Semen oil by response surface methodology and studies on its antioxidant activity.Chin J Chin Mater Med (中國(guó)中藥雜志)，2011，36:3253-3257.
王國(guó)凱，王 諍，蔡百祥，高衛(wèi)娜，劉勁松，王 剛
安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 現(xiàn)代中藥安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230012
馬蘭［Kalimeris indica (L.)Sch.-Bip］為菊科馬蘭屬植物［1］，具有涼血、清熱、利濕、解毒等功效［2］。臨床使用馬蘭治療乙肝的臨床多有報(bào)道，且療效顯著［3，4］。三萜類(lèi)化合物是廣泛存在于中藥中的一類(lèi)化合物，多數(shù)三萜由30 個(gè)碳原子組成。研究表明三萜類(lèi)化合物具廣泛的生物活性，具有較強(qiáng)的抗炎、抗菌、抗腫瘤等生物活性［5］，在前期研究的基礎(chǔ)上［6］，本實(shí)驗(yàn)旨在運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)選馬蘭最佳提取工藝，繼而最大限度提取馬蘭總?cè)疲ＷC能充分利用馬蘭藥材資源，提高經(jīng)濟(jì)效益，為研究開(kāi)發(fā)馬蘭提供科學(xué)依據(jù)。
1 材料與儀器
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
馬蘭全草2013年購(gòu)自安徽亳州藥材市場(chǎng)，標(biāo)本經(jīng)中藥標(biāo)本中心楊青山老師鑒定為菊科馬蘭屬植物馬蘭;齊墩果酸(批號(hào):110709 -201311)購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司;其它試劑均為分析純。
1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
UV757CRT 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(島津);AG-285 型十萬(wàn)分之一電子天平(賽多利斯);DZF-6050型真空干燥箱(上海博迅)。
2 實(shí)驗(yàn)方法
2.1 對(duì)照品溶液的制備
精密稱(chēng)取齊墩果酸對(duì)照品10.07 mg，用90%乙醇定容至50 mL，制成0.2014 mg/mL 的溶液作為對(duì)照品溶液。
2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制
分別吸取對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，置于試管中，水浴蒸干，分別加入新配制的5 %香草醛-冰醋酸0.2 mL 和高氯酸1.2 mL，搖勻后，置于70 ℃水浴加熱15 min，冷卻至室溫，加乙酸乙酯3.6 mL，隨行試劑做空白，波長(zhǎng)550 nm 處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。回歸方程y=48.619x-0.0742(r=0.9983)。
2.3 供試品溶液的制備及含量測(cè)定
精確稱(chēng)取馬蘭提取物0.1 g，用90%乙醇定容至50 mL 容量瓶中超聲至完全溶解。取2 mL 溶液，用90%乙醇定容至10 mL 容量瓶，搖勻。取供試品溶液1 mL 于試管中，85 ℃水浴蒸干，加入新配制的5%香草醛冰醋酸(5g 香草醛用冰醋酸溶解后，定容至100 mL)0.2 mL，高氯酸1.2 mL，放至70 ℃水浴中加熱15 min。取出流水冷卻至室溫，加乙酸乙酯3.6 mL，隨行試驗(yàn)做空白［7，8］。用紫外分光光度計(jì)波長(zhǎng)550 nm 處測(cè)定，代入回歸方程供試品中馬蘭總?cè)频暮俊?/p>
2.4 單因素試驗(yàn)
2.4.1 乙醇濃度考察
稱(chēng)取藥材50 g 各五份，以提取時(shí)間為1.5 h，提取次數(shù)為3 次，料液比為1∶15 g/mL，乙醇濃度分別以40%、50%、60%、70%、80%回流提取。
2.4.2 料液比考察
稱(chēng)取藥材50 g 各五份，以提取時(shí)間為1.5 h，提取次數(shù)為3 次，料液比分別以1 ∶9、1 ∶12、1 ∶15、1∶18、1∶21 g/mL 50%乙醇回流提取。
2.4.3 提取時(shí)間考察
稱(chēng)取藥材50 g 各五份，料液比為1 ∶15 g/mL 90%乙醇，提取次數(shù)為3 次，提取時(shí)間分別以0.5、1、1.5、2、2.5 h 進(jìn)行回流提取。
2.4.4 提取次數(shù)考察
稱(chēng)取藥材50 g 各五份，料液比為1 ∶15 g/mL 90%乙醇，提取時(shí)間為1.5 h，提取次數(shù)分別以1、2、3、4、5 次進(jìn)行回流提取。
2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化馬蘭總?cè)频奶崛」に?/h3>
在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理［9，10］，選出影響馬蘭總?cè)迫÷实乃膫€(gè)主要因素:乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)、提取次數(shù)(D)，進(jìn)行這四個(gè)因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，考察目標(biāo)為總?cè)铺崛÷省２捎肈esign-Expert 8.0.5b 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。
表1 響應(yīng)面分析因素及水平Table 1 Factors and levers of RSM analysis
圖1 乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)及提取次數(shù)(D)對(duì)馬蘭總?cè)频挠绊慒ig.1 Effects of ethanol concentration (A)，solid/liquid ratio (B)，ultrasonic duration (C)and times of extraction (D)on the yield of total triterpenes
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果
單因素試驗(yàn)考察結(jié)果可知50%乙醇、1∶15 g/mL、提取1.5 h、提取3 次提取最佳。
3.2 響應(yīng)面結(jié)果
以乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)、提取次數(shù)(D)為自變量，以得率(Y)為響應(yīng)值，用Design-Expert 8.0.5b 軟件進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
表2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The result of response surface design
對(duì)以上中心組合數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，可得到二次響應(yīng)面的回歸方程為:Y=+0.024-1.541E-003 ×A +3.869E-004 ×B+2.938E-004 ×C+2.493E-003 ×D-3.825E-004 ×AB +1.087E-003 ×AC-1.366E-003 ×AD-1.892E-004 ×BC-1.821E-004 × BD-1.395E-003×CD-2.454E-004 ×A2-2.501E-004 ×B2 +2.577E-004 ×C2-2.527E-003 ×D2
由回歸方程可知，對(duì)馬蘭總?cè)铺崛÷实挠绊懘笮№樞驗(yàn)?提取次數(shù)＞乙醇濃度＞料液比＞提取時(shí)間。對(duì)該方程進(jìn)行回歸分析。
表3 回歸分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for the developed polynomial model
結(jié)果表明A、B、C、D、AB、AC、AD、CD、A2、B2、C2、D2因素對(duì)馬蘭總?cè)频奶崛÷视绊戯@著，表明四個(gè)因素均有顯著的影響;其中AB、AC、CD 顯著表明在提取過(guò)程中乙醇濃度和料液比，乙醇濃度和提取時(shí)間，提取時(shí)間和提取次數(shù)的交互作用也會(huì)對(duì)馬蘭總?cè)铺崛÷蕩?lái)顯著影響。進(jìn)一步分析方程方差可知，由總模型P＜0.001 可知本實(shí)驗(yàn)所選取的二次多項(xiàng)式模型具有高度的顯著性;失擬項(xiàng)為0.8812＞0.05，故失擬項(xiàng)不顯著;決定系數(shù)R2=0.9959，校正決定系數(shù)R2Adj=0.9919，結(jié)果說(shuō)明模型可以解釋響應(yīng)值的變化，說(shuō)明擬合度較好，可以采用此模型對(duì)馬蘭總?cè)频奶崛」に囘M(jìn)行優(yōu)化。
3.3 響應(yīng)面圖與等高線(xiàn)圖分析
圖2A～D 是根據(jù)多元回歸方程得到的四個(gè)因素對(duì)馬蘭總?cè)铺崛÷视绊懙捻憫?yīng)面圖及等高線(xiàn)圖。圖2A 顯示了乙醇濃度與料液比對(duì)馬蘭總?cè)频寐实慕换プ饔茫蓤D可知，等高線(xiàn)呈橢圓形，說(shuō)明乙醇濃度和料液比之間的交互作用顯著。圖2B 顯示了乙醇濃度與提取時(shí)間對(duì)馬蘭總?cè)频寐实慕换プ饔茫蓤D可知，等高線(xiàn)呈橢圓形，說(shuō)明乙醇濃度與提時(shí)間之間的交互作用顯著。圖2C 顯示了乙醇濃度與提次數(shù)對(duì)馬蘭總?cè)频寐实慕换プ饔茫蓤D可知，等高線(xiàn)呈橢圓形，說(shuō)明乙醇濃度與提次數(shù)之間的交互作用顯著。圖2D 顯示了提取時(shí)間與提次數(shù)對(duì)馬蘭總?cè)频寐实慕换プ饔茫蓤D可知，等高線(xiàn)呈橢圓形，說(shuō)明提取時(shí)間與提次數(shù)之間的交互作用顯著。
3.4 驗(yàn)證性試驗(yàn)
圖2 各交互作用對(duì)馬蘭總?cè)朴绊懙捻憫?yīng)曲面Fig.2 Response surface plots showing the interactive effects of different factors on the yield of total triterpenes
通過(guò)數(shù)據(jù)分析，可得到馬蘭總?cè)铺崛〉淖罴压に嚍?乙醇濃度40%;料液比1∶18 g/mL;提取時(shí)間1 h;提取次數(shù)3.98 次。在此條件下，馬蘭總?cè)铺崛÷实睦碚撝禐?.83758%。綜上考慮:提取次數(shù)為4 次。驗(yàn)證性試驗(yàn)在此條件下平行提取3 次，測(cè)得實(shí)際提取率均值為2.68%。
4 結(jié)論
本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)運(yùn)用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)優(yōu)化馬蘭總?cè)频淖罴烟崛」に嚍橐掖紳舛?0%，料液比1∶18 g/mL，提取次數(shù)4 次，提取時(shí)間1 h。經(jīng)最佳工藝得到的馬蘭總?cè)频暮繛?6.83 mg/g。
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