響應(yīng)面法優(yōu)化纖維素酶協(xié)同提取沙棘籽粕原花青素的工藝研究

歐陽健，金家宏，王洪倫

1中國科學院西北高原生物研究所，西寧 810001;2中國科學院大學，北京 100049;3 伽藍(集團)股份有限公司，上海 200233

沙棘(Hippophae rhamnoides L.)是胡頹子科沙棘屬植物，為灌木或喬木，青藏高原是沙棘的起源地，青海是沙棘的重要分布區(qū)。沙棘資源具有分布廣、品種多和耐旱強等特點，僅青海省內(nèi)，天然沙棘林面積5.3 萬hm2，人工林面積7.3 萬hm2，未成林造林面積達7.4 萬hm2，具有很大的產(chǎn)業(yè)開發(fā)潛力［1］。沙棘籽粕為沙棘籽超臨界CO2萃取油脂后的工業(yè)廢料，經(jīng)檢測其蛋白質(zhì)含量為20%，糖分為11.35%，脂肪為10.9%，總植物堿2.92 mg/kg，總黃酮502 mg/kg，另外還富含氨基酸、維生素等生物活性成分［2］。

現(xiàn)代藥理學研究表明［3-5］，沙棘具有抗腫瘤、抗心血管疾病和免疫調(diào)節(jié)等生物活性，尤其是沙棘中所含的原花青素類化合物具有較強的抗氧化及免疫調(diào)節(jié)等生理功能［6-9］。原花青素［10］是一類具有特殊分子結(jié)構(gòu)的生物黃酮，是由不同數(shù)量的兒茶素和表兒茶素結(jié)合形成的聚合物，其中2～5 倍體被稱為低聚原花青素，大于5 倍體的稱為高聚原花青素。體外藥理試驗表明，原花青素是一種高效的抗氧化劑，它的抗自由基氧化能力是維生素E 的50 倍，維生素C 的20 倍，并且它在體內(nèi)的半衰期長達6.67±0.95 h［11，12］。原花青素類化合物主要存在于大多數(shù)植物的果實、種子等組織中，對植物有著重要的保護作用［13］。沙棘果實被工業(yè)利用后的渣粕中仍含有較高的原花青素，以沙棘籽粕為原料研究原花青素的提取工藝，對沙棘資源的開發(fā)具有一定意義。

目前，以沙棘籽粕為原料進行原花青素的提取工藝研究較少，金海英［14］等研究了沙棘籽原花青素提取的單因素實驗，張弛［15］等對沙棘果原花青素的分離純化進行了研究，梅金龍［16］等研究了沙棘籽粕原花青素提取純化工藝。此外，禹華娟［17］等研究了蓮房原花青素的酶輔助提取工藝。纖維素酶協(xié)同超聲對沙棘籽粕原花青素的提取相關(guān)工藝未見報道。因此，本研究擬研究纖維素酶協(xié)同超聲提取沙棘籽粕原花青素的工藝，采用香草醛-鹽酸法［18］測定原花青素的含量并計算原花青素提取得率。通過單因素及響應(yīng)面法對原花青素的提取工藝進行篩選優(yōu)化，為沙棘籽粕原花青素的生產(chǎn)利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

沙棘籽粕，于2013年取自青海康普生物科技股份有限公司提取籽油后籽粕;兒茶素標準品，購自成都曼思特生物科技有限公司;纖維素酶，BBL 公司，酶活力15000 U/g。

UV-759 型紫外-可見光分光光度計、PHS-3C 型pH 計，上海精密科學儀器有限公司;優(yōu)普超純水器，成都超純水有限公司;超微粉碎機，浙江省溫嶺市創(chuàng)力藥材器械廠。

甲醇、鹽酸、香草醛均為分析純，天津百世化工有限公司。

1.2 方法

1.2.1 材料制備

將沙棘籽粕粉碎過60 目篩，得到試驗材料，放置于冰箱冷凍備用。

1.2.2 原花青素含量的測定［18］

1.2.2.1 標準曲線的繪制

配制兒茶素標準溶液，濃度為1.2 mg/mL。分別量取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，然后定容至10 mL。準確量取各濃度兒茶素標準溶液1.0 mL，加入1%香草醛甲醇溶液2.5 mL 和8%鹽酸甲醇溶液2.5 mL，搖勻，避光，在30±1 ℃下，恒溫水浴保持30 min 后取出，用分光光度法在500 nm 波長下，測定其吸光值，得回歸方程為y=0.38x +0.02，R=0.9994，線性范圍為0.12～0.62 mg/mL。

1.2.2.2 樣品測定

準確稱取1.000 g 左右沙棘籽粕粉末，加入一定體積的甲醇，按各方案進行提取后，4000 rpm 離心15 min，取上清1.0 mL，按上述測定方法進行保溫比色，并按標準曲線回歸方程對原花青素提取得率進行計算。

1.2.3 試驗設(shè)計方法

該研究通過料液比、提取時間、提取次數(shù)、酶的用量和提取液pH 等因素的試驗結(jié)果，篩選出對沙棘籽粕原花青素提取工藝影響較大的因素，進行Box-Behnken 中心組合試驗設(shè)計(見表1)。

表1 Box-Behnken 設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels in Box-Behnken design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 料液比對沙棘籽粕原花青素提取得率的影響

沙棘籽粕原花青素的提取過程中，設(shè)置不同的料液比，在室溫下，甲醇溶液超聲輔助提取45 min，研究料液比對原花青素提取的影響，結(jié)果見圖1A。原花青素的提取得率隨著料液比的增加而呈現(xiàn)增加的趨勢，其中料液比為1∶30 g/mL 時，原花青素提取得率較高，而后變化趨勢不明顯。因此選取料液比1∶30 g/mL 進行其他單因素試驗。

2.1.2 提取時間對沙棘籽粕原花青素提取得率的影響

沙棘籽粕原花青素的提取過程中，設(shè)置不同的提取時間，在室溫下，料液比為1∶30 g/mL，甲醇超聲輔助提取，研究提取時間對原花青素提取的影響，結(jié)果見圖1B。原花青素的提取得率隨提取時間的增加有一定的增加，45 min 前變化趨勢較為明顯，而后變化趨于平緩。因此，選擇甲醇超聲輔助提取時間45 min、料液比1∶30 g/mL 進行其他單因素試驗。

2.1.3 提取次數(shù)對沙棘籽粕原花青素提取得率的影響

沙棘籽粕原花青素的提取過程中，考慮不同的提取次數(shù)，在室溫下，料液比為1∶30 g/mL，甲醇超聲輔助提取45 min，研究提取次數(shù)對沙棘籽粕原花青素提取的影響，結(jié)果見圖1C。原花青素的提取得率對提取次數(shù)的增加有一定的變化，但變化趨勢較為不明顯，尤其是提取3 次以上幾乎無差異，因此，甲醇超聲輔助提取3 次、每次45min、料液比1∶30 g/mL 進行其他單因素試驗。

2.1.4 酶的用量對沙棘籽粕原花青素提取得率的影響

試驗選用纖維素酶協(xié)同甲醇超聲提取沙棘籽粕中的原花青素，考慮不同纖維素酶的用量，在室溫下，料液比為1 ∶30 g/mL，甲醇超聲輔助提取45 min，研究酶的用量對沙棘籽粕原花青素提取的影響，結(jié)果見圖1D。沙棘籽粕中，原花青素需突破細胞壁的束縛才能進入提取溶劑中，細胞壁的主要成分之一即為纖維素，它在纖維素酶的催化作用下，可快速降解，使細胞壁出現(xiàn)裂解的現(xiàn)象，使原花青素更易進入提取溶劑中，提高其提取得率［19］。試驗結(jié)果表明，在纖維素酶的作用下，原花青素的提取得率有明顯的提高，但當酶的用量達到3%(每1 g 原料添加0.03 g 纖維素酶，下同)后，原花青素的提取得率無明顯變化。因此，選擇甲醇超聲輔助提取3 次、每次45 min、料液比1∶30 g/mL 和酶的用量為3%進行其他單因素試驗。

2.1.5 提取液pH 對沙棘籽粕原花青素提取得率的影響

試驗選用纖維素酶協(xié)助甲醇超聲提取沙棘籽粕中的原花青素，而酶活力容易受到pH 影響。因此，在提取過程中，考慮提取液pH，在室溫下，甲醇超聲輔助提取3 次、每次45 min、料液比1∶30 g/mL 和酶的用量為3%，研究提取液pH 對沙棘籽粕原花青素提取的影響，結(jié)果見圖1E。試驗表明，當pH 小于3或大于7 時，原花青素的提取得率均處于較低水平，而當pH 為5 時，原花青素的提取得率最高，且表明pH 對原花青素提取得率影響較大，其原因可能與提取液pH 對纖維素酶的影響有關(guān)，纖維素酶的最佳pH 在4.0～5.5 之間［20］。當提取液pH 過酸和過堿，均使纖維素酶不能具有較高的催化效率，而影響原花青素的提取得率。

2.2 響應(yīng)面法試驗設(shè)計及結(jié)果

2.2.1 分析單因素結(jié)果顯示

甲醇超聲輔助提取3 次、酶的用量為3%時沙棘籽粕原花青素有最大的提取率。沙棘籽粕原花青素提取的響應(yīng)面試驗設(shè)計及試驗結(jié)果見表2，結(jié)合Box-Behnken 中心組合實驗設(shè)計原理，按照表1 對提取時間、料液比和提取液pH 作變換，以原花青素提取得率為響應(yīng)值(Y)，共17 個試驗點，其中1～12 組為析因試驗，13～17 組為中心試驗，用來分析試驗誤差。

表2 原花青素提取得率試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface analysis for the optimization of extraction conditions of PC

采用Design Expert 8.05b 軟件對沙棘原花青素提取得率數(shù)據(jù)進行回歸擬合分析，得回歸方程:原花青素提取得率Y=3.08+0.080X1+0.068X2+0.16X3+2.5 ×10-3X1X2-0.027X1X3-2.5 ×10-3X2X3-。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA of regression analysis

2.2.2 模型的顯著性檢驗

從回歸模型方差分析(表3)可見，試驗選用的模型極顯著(P＜0.0001)，失擬項不顯著P=0.1066＞0.05，說明模型是適合的;模型的校正決定系數(shù)=0.9961，說明該模型能解釋99.61%響應(yīng)值的變化，僅有總變異大約0.39%不能用該模型進行解釋;相關(guān)系數(shù)R2=0.9983，說明該模型擬合程度較好，預(yù)測值與實測值之間有較好的相關(guān)性，試驗誤差小，可以用該模型來分析和預(yù)測沙棘籽粕原花青素的提取得率。

由表3 方差分析結(jié)果可知，在此試驗設(shè)計中，一次項X1、X2、X3均極顯著(P＜0.01)，二次項X1X2、X2X3、X1X3均不顯著(P＞0.05)，均極顯著(P＜0.01)。

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析

回歸模型的響應(yīng)面及其等高線見圖2，3 組圖直觀地反映了各因素對響應(yīng)值的影響。由三組圖對比可知，提取液pH(X3)對沙棘籽粕原花青素提取得率影響最為顯著，表現(xiàn)為圖2B1、2C1 的曲面較陡。等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強弱，橢圓表示兩因素交互作用顯著，圓形則相反。由圖2B2、2C2等高線可得知，提取時間與pH 值和料液比與pH 值的交互作用較為明顯，表現(xiàn)為等高線略成橢圓形。相比而言，提取時間與料液比之間的交互作用稍弱。

圖2 提取時間(X1)與料液比(X2)、提取時間(X1)與提取液pH(X3)及提取時間(X1)與提取液pH(X3)交互作用響應(yīng)面圖(A1、B1、C1)與等高線圖(A2、B2、C2)Fig.2 Responsive surface plots (A1、B1、C1)and contour plots (A2、B2、C2)showing the mutual effects of extraction duration(X1)and ratio of solid to liquid (X2)，extraction duration (X1)and pH value of extraction solvent (X3)，ratio of solid to liquid (X2)and pH value of extraction solvent (X3)on the yield of PC

2.2.4 最優(yōu)提取工藝參數(shù)

通過Design-Expert8.05b 軟件求解回歸方程得出的最佳提取工藝參數(shù)為:纖維素酶協(xié)同甲醇超聲提取，超聲功率250 W，室溫下，酶的用量為3%，提取時間54.02 min，料液比32.01 g/mL，pH 值為5.31 提取3 次，測定并計算原花青素提取得率。綜合考慮試驗的操作性、效率和成本等，將沙棘籽粕原花青素提取工藝參數(shù)修正為:纖維素酶協(xié)同甲醇超聲提取，超聲功率250 W，室溫下，酶的用量為3%，提取時間55 min，料液比1∶30 g/mL，pH 值為5.0，提取3 次，此條件下，沙棘籽粕原花青素提取得率的理論值達到3.09%。

2.2.5 試驗?zāi)Ｐ偷尿炞C和比較

按照模型得到的最優(yōu)提取參數(shù)與實踐過程中的簡便性得到的最終條件驗證試驗?zāi)Ｐ汀Ｔ囼灲Y(jié)果表明，模型提取參數(shù)按實際操作簡化后實際提取得率為(3.07±0.0080)%，與理論最大值非常接近，說明該模型可以較好的反映沙棘籽粕原花青素的提取參數(shù)，也說明用響應(yīng)面法對原花青素提取得率進行參數(shù)優(yōu)化是可行的。

3 結(jié)論

利用纖維素酶協(xié)同甲醇超聲輔助提取沙棘籽粕原花青素，通過單因素試驗篩選出料液比、提取時間和提取液pH 值對原花青素提取得率的影響較為明顯，進一步根據(jù)Box-Benhnken 原理進行響應(yīng)面試驗設(shè)計，優(yōu)化沙棘籽粕原花青素提取的最佳工藝參數(shù)，并進行穩(wěn)定性的檢驗。根據(jù)響應(yīng)面分析模型方程Y=3.08+0.080X1+0.068X2+0.16X3+2.510-3，得出沙棘籽粕原花青素的最佳提取工藝參數(shù):纖維素酶協(xié)同甲醇超聲提取，超聲功率250 W，室溫下，酶的用量為3%，提取時間55 min，料液比1∶30 g/mL，pH 值為5.0，提取3 次。在此條件下，沙棘籽粕原花青素提取得率為3.07%。該研究通過單因素及響應(yīng)面法對原花青素的提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化篩選，為沙棘籽粕中原花青素的生產(chǎn)利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

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